1.前言

在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是基因克隆的基礎(chǔ)步驟之一。但相信很多同學(xué)在涂板后，常常會(huì)出現(xiàn)平板上菌落稀少甚至“空空如也”的尷尬局面，這不僅耽誤我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，還會(huì)消耗寶貴的試劑和時(shí)間。實(shí)驗(yàn)為何會(huì)卡在這一步？本篇文章，將從幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，一起和大家好好探討一下這個(gè)問(wèn)題。

2.感受態(tài)細(xì)胞“不給力”

感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率直接決定了實(shí)驗(yàn)成敗。如果細(xì)胞本身質(zhì)量不佳，后續(xù)操作再完好也無(wú)濟(jì)于事。例如感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)常反復(fù)凍融或長(zhǎng)期儲(chǔ)存（超過(guò)6個(gè)月），則很有可能會(huì)導(dǎo)致其活性顯著下降。

感受態(tài)細(xì)胞是非常脆弱的，一些操作上的失誤同樣會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效率，凍融過(guò)程中如果未將細(xì)胞置于冰上，則可能會(huì)破壞細(xì)胞膜的脆弱結(jié)構(gòu)；解凍后若未及時(shí)使用（如放置超過(guò)10分鐘），細(xì)胞活性會(huì)快速下降；加入質(zhì)粒后劇烈吹打也會(huì)破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步降低轉(zhuǎn)化成功率。正確的操作應(yīng)該是：凍融時(shí)需全程冰上操作，解凍后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，質(zhì)粒加入后僅需輕彈混勻。

3 質(zhì)?！坝昧俊辈划?dāng)或與宿主菌不兼容

質(zhì)粒是轉(zhuǎn)化成功的核心，但它的用量常被忽視。在感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒的用量需通過(guò)質(zhì)量（ng） 而非體積（μL）去控制。

若僅依賴(lài)體積添加，就可能會(huì)因?yàn)橘|(zhì)粒濃度差異導(dǎo)致實(shí)際用量超出合理范圍（通常建議是 50-100 ng），進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化效率。我們可以利用分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒濃度，再依照公式：體積（μL）= 目標(biāo)質(zhì)量（ng） / 質(zhì)粒濃度（ng/μL），計(jì)算出所需添加的體積。

某些質(zhì)粒需要特定宿主菌才能正常復(fù)制或表達(dá)。例如pET系列質(zhì)粒需使用BL21(DE3)菌株表達(dá)蛋白，因?yàn)樵摼晖ㄟ^(guò)λ噬菌體DE3溶源整合，染色體攜帶T7 RNA聚合酶基因，可驅(qū)動(dòng)pET質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因。若質(zhì)粒與宿主菌的復(fù)制起點(diǎn)不兼容不匹配，則可能導(dǎo)致質(zhì)粒無(wú)法復(fù)制，轉(zhuǎn)化后無(wú)菌落。

4 熱激條件不“精準(zhǔn)”

熱激是感受態(tài)細(xì)胞吸收質(zhì)粒的關(guān)鍵步驟，其溫度、時(shí)間和操作順序需嚴(yán)格控制。若條件不精準(zhǔn)，可能導(dǎo)致質(zhì)粒無(wú)法有效進(jìn)入細(xì)胞或細(xì)胞膜修復(fù)過(guò)快，影響轉(zhuǎn)化效率。熱激時(shí)間過(guò)短，會(huì)導(dǎo)致無(wú)法充分打開(kāi)細(xì)胞膜孔道；而熱激時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能損傷細(xì)胞。

熱激完后，我們還需要將細(xì)胞放在冰上冰浴一段時(shí)間，這一步的目的是修復(fù)細(xì)胞膜裂隙，避免細(xì)胞因膜結(jié)構(gòu)破損而死亡。如果少了這一步，就可能導(dǎo)致細(xì)胞膜無(wú)法閉合，轉(zhuǎn)化效率下降或細(xì)胞死亡。

5 抗生素“過(guò)量”或“失效”

抗生素是篩選成功轉(zhuǎn)化的抗性菌落的關(guān)鍵，但如果抗生素失效或濃度過(guò)高會(huì)直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化菌篩選失敗。儲(chǔ)存不當(dāng)或過(guò)期的抗生素會(huì)失去抑菌活性，而濃度過(guò)高則會(huì)抑制目標(biāo)菌生長(zhǎng)。操作失誤，如使用添加錯(cuò)誤類(lèi)型抗性平板，也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

6 涂板操作不“細(xì)致”

涂板是轉(zhuǎn)化的最后一步，一些操作上的細(xì)節(jié)疏漏也可能導(dǎo)致前功盡棄。涂布量過(guò)多或過(guò)少會(huì)影響菌落密度與生長(zhǎng)效率，建議控制涂布量在10-50 μL。菌液未充分混勻或涂布器未覆蓋整個(gè)平板表面，導(dǎo)致局部菌落過(guò)密或空白。而如果使用涂布棒用力摩擦瓊脂表面，損傷細(xì)胞或菌液堆積。

正確的操作應(yīng)該是：加入菌液后，使用無(wú)菌涂布棒輕柔旋轉(zhuǎn)，充分分散菌液；涂布后需靜置5分鐘，待菌液被平板全部吸收后再倒置培養(yǎng)，防止冷凝水滴落污染菌落。

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