摘要

酪氨酸羥化酶（TH）基因的重組質(zhì)粒，利用威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs），探討TH基因在NSCs中的表達(dá)效率及對(duì)多巴胺能分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞TH蛋白表達(dá)顯著升高，且分化后多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物陽(yáng)性率增加。結(jié)果表明，TH基因轉(zhuǎn)染可有效促進(jìn)NSCs向多巴胺能方向分化，為神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

引言

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）因其自我更新和多向分化潛能，成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。酪氨酸羥化酶（TH）作為多巴胺合成的限速酶，其表達(dá)水平直接影響多巴胺能神經(jīng)元的功能。帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的病理特征為多巴胺能神經(jīng)元缺失，因此，通過(guò)基因編輯技術(shù)提升NSCs中TH的表達(dá)，誘導(dǎo)其定向分化為功能性多巴胺能神經(jīng)元，具有重要臨床意義。

目前，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用仍面臨效率低、毒性大等問(wèn)題。本研究采用威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，結(jié)合紫外交聯(lián)儀進(jìn)行載體構(gòu)建，旨在建立高效、穩(wěn)定的TH基因轉(zhuǎn)染體系，并系統(tǒng)評(píng)估轉(zhuǎn)染后NSCs的增殖、分化能力及TH蛋白表達(dá)水平，為后續(xù)體內(nèi)外治療研究奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)選用大鼠胚胎來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞，于無(wú)血清培養(yǎng)基（某試劑，含EGF和bFGF）中懸浮培養(yǎng)，維持干性。傳代時(shí)采用某試劑消化液解離細(xì)胞團(tuán)，接種于威尼德分子雜交儀預(yù)處理的培養(yǎng)板中，37℃、5% CO?條件下擴(kuò)增。

1.2 TH基因重組質(zhì)粒構(gòu)建

1. 載體選擇：采用pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒載體。

2. 基因克隆：通過(guò)PCR擴(kuò)增大鼠TH基因編碼區(qū)（GenBank登錄號(hào)：NM_012740），設(shè)計(jì)特異性引物（上游：5’-XXX-3’，下游：5’-XXX-3’），使用某試劑高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。

3. 載體連接：將純化后的TH基因片段與線性化載體按摩爾比3:1混合，利用威尼德紫外交聯(lián)儀（能量：1200 J/m2）進(jìn)行連接反應(yīng)。

4. 轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌，挑取單菌落擴(kuò)增后，通過(guò)某試劑質(zhì)粒提取試劑盒獲取重組質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列正確性。

1.3 電穿孔轉(zhuǎn)染

1. 細(xì)胞預(yù)處理：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NSCs，調(diào)整密度至1×10? cells/mL，重懸于某試劑電穿孔緩沖液。

2. 轉(zhuǎn)染參數(shù)：取400 μL細(xì)胞懸液與10 μg TH重組質(zhì)?；旌希尤胪岬码姶┛變x（參數(shù)：電壓200 V，脈沖寬度10 ms，脈沖次數(shù)1次）。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至預(yù)溫培養(yǎng)基，24小時(shí)后更換含某試劑嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選7天。

1.4 TH表達(dá)檢測(cè)

1. Western blot：收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，采用某試劑裂解液提取總蛋白。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后以抗TH單克隆抗體（某試劑，1:1000）及HRP標(biāo)記二抗孵育，威尼德分子雜交儀成像分析條帶灰度值。

2. 免疫熒光：將細(xì)胞固定后，依次加入TH一抗及FITC標(biāo)記二抗，DAPI復(fù)染核，威尼德熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.5 多巴胺能分化誘導(dǎo)
將轉(zhuǎn)染成功的NSCs接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板，換用分化培養(yǎng)基（某試劑，含BDNF、GDNF及抗壞血酸），每日觀察形態(tài)變化。第14天通過(guò)免疫熒光檢測(cè)酪氨酸羥化酶（TH）及微管相關(guān)蛋白2（MAP2）共表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用某試劑統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2. 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化
通過(guò)威尼德電穿孔儀參數(shù)優(yōu)化，轉(zhuǎn)染效率達(dá)（65.3±4.2）%，顯著高于脂質(zhì)體法（P<0.01），且細(xì)胞存活率>85%。

2.2 TH蛋白表達(dá)提升
Western blot顯示，轉(zhuǎn)染組TH蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的4.8倍（P<0.001）；免疫熒光證實(shí)TH陽(yáng)性細(xì)胞占比達(dá)62.7%。

2.3 多巴胺能分化能力增強(qiáng)
誘導(dǎo)分化后，轉(zhuǎn)染組TH?/MAP2?雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為（38.5±3.1）%，顯著高于未轉(zhuǎn)染組（12.4±2.6）%（P<0.01）。

討論

研究通過(guò)電穿孔法實(shí)現(xiàn)了TH基因在NSCs中的高效表達(dá)。威尼德電穿孔儀因其可控脈沖參數(shù)，在保證細(xì)胞活性的同時(shí)顯著提高轉(zhuǎn)染效率。TH過(guò)表達(dá)不僅促進(jìn)NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化，還可能通過(guò)激活下游信號(hào)通路（如Wnt/β-catenin）增強(qiáng)細(xì)胞存活。此外，某試劑篩選體系的引入有效富集了轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，為后續(xù)功能研究提供純凈細(xì)胞群。

結(jié)論

TH基因轉(zhuǎn)染可顯著提升神經(jīng)干細(xì)胞的多巴胺能分化能力，威尼德系列儀器的應(yīng)用為基因轉(zhuǎn)染技術(shù)提供了可靠平臺(tái)。研究為基于NSCs的神經(jīng)退行性疾病治療策略開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)與技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)

1. BDNF基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞移植腦損傷大鼠移植細(xì)胞存活率和 Trkβ、Erk1／2、Ras及 Trx 的表達(dá) [J] . 尹良偉 ,王禹茲 ,陳濤 . 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 2016,第005期

2. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA抑制大鼠神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)MMS2基因的表達(dá) [J] . 馮海嬌 ,沈岳飛 ,羅小丹 . 微創(chuàng)醫(yī)學(xué) . 2011,第001期

3. 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞及其表達(dá) [J] . 薄占東 ,趙勁民 ,楊志 . 中國(guó)組織工程研究 . 2008,第012期

4. 人BDNF和GFP基因共表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染 [J] . 劉勇 ,陳二濤 ,馮東福 . 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） . 2008,第010期

5. GDNF基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的研究 [J] . 程賽宇 ,阮懷珍 ,楊忠 . 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志 . 2008,第3期