Piezo1-mediated stellate cell activation causes pressure-induced pancreatic fibrosis in mice

Keywords: Fibrosis; Gastroenterology.

慢性胰腺炎是一種胰腺組織進(jìn)行性炎癥性疾病，其特征是產(chǎn)生胰島素的 β 細(xì)胞纖維化和丟失。一旦胰腺纖維化發(fā)展，胰腺功能的恢復(fù)就會(huì)受到限制。盡管飲酒是慢性胰腺炎的主要原因，但基因突變和胰管阻塞是其他的促成因素。這些原因都會(huì)引起胰腺纖維化，從而導(dǎo)致組織瘢痕形成和胰管狹窄，這兩者都會(huì)導(dǎo)致胰管內(nèi)壓升高。因此，胰管內(nèi)壓力升高似乎會(huì)導(dǎo)致胰腺纖維化，而胰腺纖維化會(huì)進(jìn)一步加劇胰腺壓力。

研究證明，胰腺腺泡細(xì)胞通過(guò)機(jī)械激活的離子通道 Piezo1 感知壓力。由剪切應(yīng)力、膜拉伸或高壓引起的膜張力會(huì)打開 Piezo1 通道，允許陽(yáng)離子內(nèi)流，主要是 Ca2+。過(guò)度的 Piezo1 激活會(huì)產(chǎn)生異常高濃度的細(xì)胞內(nèi)鈣（[Ca2+]i），這對(duì)細(xì)胞有有害影響。

胰腺纖維化是由活化的胰腺星狀細(xì)胞（PSCs）分泌的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白沉積引起的。然而，力引發(fā)這些影響的機(jī)制尚不清楚?；趯?duì)導(dǎo)管阻塞導(dǎo)致胰腺纖維化的觀察，美國(guó)杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)系團(tuán)隊(duì)假設(shè) PSCs 也對(duì)壓力敏感，并在研究中闡明了 PSCs 表達(dá)機(jī)械敏感的離子通道 Piezo1，而這是壓力誘導(dǎo)的胰腺纖維化的原因。研究成果發(fā)表于 JCI Insight 期刊題為“Piezo1-mediated stellate cell activation causes pressure-induced pancreatic fibrosis in mice”。

首先，通過(guò)結(jié)扎胰腺尾部區(qū)域建立一個(gè)臨床相關(guān)的阻塞性胰腺炎模型來(lái)評(píng)估胰腺內(nèi)壓力對(duì)纖維化的影響（圖1 A）。5 分鐘后尾部區(qū)域的胰腺壓力從 8.5 mmHg（未結(jié)扎壓力）增加到 22.7 mmHg（結(jié)扎壓力）（圖1 B）。胰管結(jié)扎（PDL）8 天后，在尾部區(qū)域觀察到明顯的胰腺纖維化，胰腺未結(jié)扎區(qū)域未受影響（圖1 D-G、J）。30 天后仍觀察到類似的結(jié)果（圖1 H、K），伴隨膠原蛋白大量沉積的是尾部區(qū)域的內(nèi)分泌和外分泌組織的受損（圖1 J、K）。這些數(shù)據(jù)表明，胰內(nèi)壓升高會(huì)導(dǎo)致胰腺纖維化。

導(dǎo)管阻塞誘導(dǎo)胰腺纖維化的證明提高了 PSCs 對(duì)壓力敏感的可能性。為了評(píng)估 Piezo1 在 PSCs 和胰腺纖維化中的潛在作用，在表達(dá)膠質(zhì)纖維狀酸性蛋白（GFAP）的星狀細(xì)胞中刪除了 Piezo1。結(jié)果表明，Piezo1GFAP-KO 小鼠免受部分導(dǎo)管結(jié)扎誘導(dǎo)的胰腺纖維化；相比之下，胰腺腺泡細(xì)胞中 Piezo1 選擇性缺失的小鼠（Piezo1aci-KO 小鼠）仍受到壓力誘導(dǎo)纖維化的影響（圖1 D-G）。同樣，導(dǎo)管結(jié)扎后 30 天，在 WT 中觀察到大量膠原蛋白沉積伴胰腺外分泌和內(nèi)分泌組織丟失，但在 Piezo1GFAP-KO 小鼠中未觀察到（圖1 H、K）。這些發(fā)現(xiàn)表明，導(dǎo)管結(jié)扎誘導(dǎo)的壓力通過(guò)激活星狀細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)胰腺纖維化，而不依賴于腺泡細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺炎。

圖1    Piezo1GFAP-KO 小鼠免受胰管結(jié)扎誘導(dǎo)的纖維化的影響。

PSCs 在胰腺纖維化中會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的 ECM 蛋白，因此實(shí)驗(yàn)假設(shè)胰內(nèi)壓力增加會(huì)刺激 PSC ECM 產(chǎn)生。為了確定可能的機(jī)械受體表達(dá)，通過(guò)免疫染色在 PSCs 中鑒定了 Piezo1，并通過(guò) [Ca2+]i 升高來(lái)證明響應(yīng)其激動(dòng)劑 Yoda1 的功能激活（圖2 A、B）。在 Piezo1 缺失的 PSCs 中不存在 Yoda1 刺激的 [Ca2+]i 增加（圖2 C、D），證實(shí)了 Yoda1 的作用對(duì) Piezo1 具有特異性。GsMTx4 是一種 Piezo1 拮抗劑，可阻斷 Yoda1 誘導(dǎo)的鈣升高（圖2 E）。去除外源性鈣消除了 Yoda1 誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流，替換鈣（2 mM）恢復(fù)了鈣流入，證明 Piezo1 介導(dǎo)的 PSCs 中 [Ca2+]i 的增加依賴于外源性鈣（圖2 F、G）。高劑量 Yoda1（25 μM）不影響 PSC 活力和膜完整性，但所有細(xì)胞都對(duì)鈣離子載體離子霉素有反應(yīng)。與小鼠 PSCs 一樣，Piezo1 通道在人 PSCs 中表達(dá)，并且對(duì) Yoda1 刺激后的 GsMTx4 阻斷敏感（圖2 H-J）。

剪切應(yīng)力和壓力等機(jī)械力是 Piezo1 的生理激活劑。對(duì) PSCs 來(lái)施加機(jī)械力，1 秒的壓力僅促使 [Ca2+]i 的瞬時(shí)上升。為了更長(zhǎng)時(shí)間地施加機(jī)械力并避免細(xì)胞適應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械推動(dòng)，使用流體剪切應(yīng)力刺激。長(zhǎng)時(shí)間的高流體剪切應(yīng)力是一種類似于阻塞性胰腺炎期間高流體壓力的情況。為了確定剪切應(yīng)力對(duì)人 PSCs 的影響，以 12 dyne/cm2 的幅度持續(xù) 1 分鐘，這產(chǎn)生了與 Yoda1（25 μM）類似的 [Ca2+]i 的持續(xù)增加。這些變化被 GsMTx4 阻止（圖2 K、L）。與高剪切力的影響相反，低剪切應(yīng)力（4 dyne/cm2，持續(xù) 1 分鐘）或持續(xù)時(shí)間較短的高剪切應(yīng)力（12 dyne/cm2，持續(xù) 5 秒）僅促使 [Ca2+]i 的瞬時(shí)上升（圖2 M-Q）。這些發(fā)現(xiàn)表明，機(jī)械力對(duì) [Ca2+]i 的影響取決于力和時(shí)間。

圖2    Piezo1 在胰腺星狀細(xì)胞中的功能表達(dá)。

正常胰腺組織中星狀細(xì)胞為靜止?fàn)顟B(tài)，靜態(tài)的胰腺星狀細(xì)胞內(nèi)含維生素A脂滴和 ECM 蛋白（如纖連蛋白和膠原蛋白）的低水平表達(dá)。激活后，PSCs 會(huì)丟失核周脂肪滴并產(chǎn)生過(guò)量的 ECM 蛋白。為了確定 Piezo1 是否具有將靜止 PSCs 轉(zhuǎn)化為活化表型的能力，將 Yoda1  應(yīng)用于人 PSCs，發(fā)現(xiàn)在 24 小時(shí)內(nèi)，近 80% 的 PSCs 失去了核周脂肪滴并變得細(xì)長(zhǎng)，平均細(xì)胞面積和最大直徑顯著增加；纖連蛋白、I 型膠原和 Piezo1 mRNA 水平也顯著升高。與人類 PSCs 一樣，Yoda1 將小鼠 PSCs 也轉(zhuǎn)化為活化表型。Yoda1 對(duì)纖維化的所有影響在 Piezo1 缺失的 PSCs 中被阻止，證實(shí)了它們對(duì) Piezo1 依賴性。

進(jìn)一步地，為了確定機(jī)械力是否通過(guò) Piezo1 介導(dǎo)星狀細(xì)胞活化，研究了有和沒有 GsMTx4 下高流體剪切應(yīng)力的影響。施加在人 PSCs 上的剪切應(yīng)力（12 dyne/cm2，持續(xù) 10 分鐘）顯著減少了核周脂肪滴的數(shù)量（圖3 A、B）。Yoda1 增加了 Piezo1 的表達(dá)，這增加了反復(fù)暴露于機(jī)械力可能誘導(dǎo) Piezo1 介導(dǎo)的纖維化反應(yīng)的可能性。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，以 24 小時(shí)的間隔施加兩次剪切應(yīng)力（25 dyne/cm2，持續(xù) 10 分鐘），并在體外檢查星狀細(xì)胞活化和纖維化反應(yīng)。重要的是，重復(fù)的剪切應(yīng)力增加了人 PSCs 中纖連蛋白和 I 型膠原蛋白水平（圖3 C-F）。用 GsMTx4 處理減輕了剪切應(yīng)力介導(dǎo)的病理變化（圖3），表明機(jī)械力通過(guò) Piezo1 誘導(dǎo)星狀細(xì)胞活化并增加 ECM 蛋白合成。

圖3    流體剪切應(yīng)力誘導(dǎo)體外星狀細(xì)胞活化和纖維化。

研究報(bào)道，Piezo1 下游信號(hào)激活胰腺腺泡細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中的 TRPV4 通道。在此研究中，研究人員在小鼠和人 PSCs 中檢測(cè)到功能性 TRPV4 通道。TRPV4 激動(dòng)劑 GSK1016790A 在靜止小鼠和人 PSCs 中使 [Ca2+]i 產(chǎn)生持續(xù)升高，并被 TRPV4 阻斷劑HC067047阻斷。

最后，為了確定 TRPV4 是否參與 PSCs 中 Piezo1 介導(dǎo)的 [Ca2+]i 變化，從 TRPV4-KO 小鼠中分離細(xì)胞。Yoda1 或長(zhǎng)時(shí)間的高剪切應(yīng)力（12 dyne/cm2，持續(xù) 1 分鐘），通常會(huì)導(dǎo)致 [Ca2+]i 持續(xù)升高，但在 TRPV4 缺失 PSCs 中僅導(dǎo)致短暫的鈣升高。TRPV4被通過(guò)PLA2-花生四烯酸（PLA2-AA）細(xì)胞色素P450環(huán)氧合酶依賴性途徑產(chǎn)生的5'-6'EET激活。為了確定 Piezo1 是否激活 PLA2-AA，使用分泌型和細(xì)胞質(zhì) PLA2 抑制劑 YM26734 和 AACOCF3，發(fā)現(xiàn)YM26734 和 AACOCF3 一起顯著抑制 WT 小鼠 PSCs 中 Yoda1 介導(dǎo)的 [Ca2+]i 持續(xù)升高。此外，GsMTx4 阻斷了高剪切應(yīng)力（12 dyne/cm2，持續(xù) 1 分鐘）對(duì) TRPV4 缺失 PSCs 中瞬時(shí) [Ca2+]i 升高的影響，證實(shí)了最初的瞬時(shí)鈣內(nèi)流是由 Piezo1 引起的，而隨后的 TRPV4 通道開放是 [Ca2+]i 持續(xù)升高的原因。

在確定 Piezo1 激活產(chǎn)生的 [Ca2+]i 持續(xù)升高需要 TRPV4 開放后，研究人員認(rèn)為 TRPV4 負(fù)責(zé)星狀細(xì)胞活化。為了測(cè)試這種可能性，用 Yoda1 處理從 TRPV4-KO 小鼠中分離的 PSCs。與 WT PSCs 相比，Yoda1 沒有激活 TRPV4-KO 小鼠的 PSCs，也沒有觀察到 PSC 激活參數(shù)（細(xì)胞形狀、核周脂肪滴豐度和 ECM 蛋白表達(dá)）的變化（圖4 A-I）。如果 Piezo1 的病理作用（高壓誘導(dǎo)的星狀細(xì)胞活化和纖維化）需要 TRPV4 通道，預(yù)計(jì)缺失 TRPV4 的小鼠將受到保護(hù)，免受壓力誘導(dǎo)的慢性胰腺炎和纖維化的影響。如圖4 J-M 所示，缺乏 TRPV4 通道的小鼠受到保護(hù)，免受 PDL 誘導(dǎo)的胰腺纖維化的影響。

圖4     TRPV4-KO 小鼠免受胰管結(jié)扎誘導(dǎo)的纖維化的影響。

圖5    圖形概要

總之，該研究表明，胰腺星狀細(xì)胞通過(guò)表達(dá)機(jī)械激活的離子通道 Piezo1 表現(xiàn)出壓力敏感性，并且 Piezo1 的激活會(huì)啟動(dòng)纖維化反應(yīng)。Piezo1 激活的病理后果的完整表現(xiàn)需要鈣觸發(fā)的 TRPV4 通道開放及其伴隨的鈣內(nèi)流。該研究觀察結(jié)果與實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一起支持了一種通過(guò)阻斷 Piezo1 或 TRPV4 通道來(lái)預(yù)防或治療胰腺纖維化的可能策略。

參考文獻(xiàn)：Swain SM, Romac JM, Vigna SR, Liddle RA. Piezo1-mediated stellate cell activation causes pressure-induced pancreatic fibrosis in mice. JCI Insight. 2022 Apr 22;7(8):e158288. doi: 10.1172/jci.insight.158288. PMID: 35451372; PMCID: PMC9089793.

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