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在精準醫(yī)療浪潮中，基因治療作為具潛力的前沿技術，從基因?qū)用嬷睋艏膊「?，有望實現(xiàn)「一次治療，終生獲益」的長期臨床效果。當下，基因治療已在罕見病、眼科疾病、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤治療等難治性疾病領域取得突破性進展。

腺相關病毒（AAV）載體憑借高轉(zhuǎn)導效率、強組織與細胞靶向性，以及低免疫原性等顯著優(yōu)勢，在基因治療領域脫穎而出，成為應用最為廣泛的基因遞送工具。

當前，美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準 8 款 AAV 基因療法上市。國內(nèi)基因治療領域進展頗多。信念醫(yī)藥研發(fā)的針對血友病 B 的 AAV 基因療法正處于獲批上市的關鍵階段，有望填補國產(chǎn) AAV 基因療法上市的空白。

今年 2 月，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院舒易來教授憑借雙 AAV 基因療法，使耳聾患者聽力得到恢復，成為 34 年來榮獲“臨床科學創(chuàng)新獎” 的亞洲科學家。

同月，特寶生物通過收購九天生物部分資產(chǎn)，將多個 AAV 基因療法研發(fā)管線納入旗下，交易總價最高可達 5800 萬美元，這一舉措助力特寶生物迅速切入 AAV 基因療法領域，加速創(chuàng)新基因治療產(chǎn)品的開發(fā)與應用，也進一步彰顯了國內(nèi) AAV 基因療法產(chǎn)業(yè)的廣闊前景。

近日，一名接受 Sarepta 杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）基因療法 Elevidys 的青少年男孩因肝功能衰竭死亡。在接受 Elevidys 臨床試驗和商業(yè)治療的 800 多名患者中，這是第一例患者死亡病例。該事件在行業(yè)內(nèi)引發(fā)軒然大波，引發(fā)各界對 AAV 基因療法安全性的深刻思考，也進一步凸顯出 AAV 生產(chǎn)環(huán)節(jié)嚴格把控的重要性。

事實上，AAV 病毒載體生產(chǎn)工藝開發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn)。生產(chǎn)環(huán)節(jié)復雜，病毒載體生產(chǎn)與純化過程中存在工藝放大難、純化難度大、穩(wěn)定性欠佳等問題，大規(guī)模生產(chǎn)仍是該領域亟待攻克的關鍵挑戰(zhàn)。

質(zhì)量源于設計（QbD）理念強調(diào)了前置藥物的質(zhì)量控制，這也意味著企業(yè)從原材料的選擇上就要嚴格把關以符合監(jiān)管要求，規(guī)避后續(xù)可能存在的風險?，F(xiàn)從 AAV 病毒生產(chǎn)上游工藝中質(zhì)粒、產(chǎn)毒株細胞和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染三個方面剖析影響 AAV 生產(chǎn)規(guī)?；挠绊懸蛩?。

質(zhì)粒是生產(chǎn) AAV 的起始原料，通常在重組大腸桿菌發(fā)酵過程中獲取。質(zhì)粒生產(chǎn)流程涵蓋發(fā)酵、菌體收集、菌體裂解、固液分離、澄清、層析以及濃縮等多個環(huán)節(jié)。在質(zhì)粒大規(guī)模發(fā)酵過程中，多個因素協(xié)同影響質(zhì)粒產(chǎn)率。

在質(zhì)粒大規(guī)模純化環(huán)節(jié)，堿裂解法是裂解菌體的常用方法。在此過程中，需嚴格控制 pH 值、剪切力和裂解時間，防止過度裂解對質(zhì)粒造成損傷。層析純化作為大規(guī)模質(zhì)粒純化的主流技術，填料孔徑的選擇對質(zhì)粒吸附性能影響顯著。企業(yè)需根據(jù)質(zhì)粒特性，選擇合適的填料，以實現(xiàn)高效純化。

理想的產(chǎn)毒株細胞系應具備生長速度快、培養(yǎng)便捷、能高效支持 AAV 病毒復制和包裝的特點。此外，細胞系來源需可溯源，無外源因子污染，并且在規(guī)?；囵B(yǎng)過程中保持傳代穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性和狀態(tài)穩(wěn)定性。

目前，HEK293 細胞貼壁培養(yǎng)技術常用于實驗室小劑量病毒生產(chǎn)。而懸浮無血清細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，如 HEK293、SF9 等細胞系的應用，極大地簡化了 AAV 生產(chǎn)的工藝放大流程，同時減輕了下游純化的負擔。

為保障細胞系在規(guī)?；囵B(yǎng)中的穩(wěn)定性，需定期進行細胞鑒定，采用 STR（短串聯(lián)重復序列）分型技術確保細胞身份的準確性，通過支原體檢測試劑盒杜絕支原體污染。

轉(zhuǎn)染效率低、質(zhì)粒 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑成本高，是 AAV 載體生產(chǎn)面臨的主要難題。

聚乙烯亞胺（PEI）是 AAV 規(guī)模化生產(chǎn)中應用廣泛的轉(zhuǎn)染試劑，雖價格低廉，但對細胞具有一定毒性，且對環(huán)境 pH 變化較為敏感。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率相對較高，細胞毒性低，然而試劑費用高昂，在大規(guī)模生產(chǎn)中成本壓力較大。磷酸鈣轉(zhuǎn)染雖成本較低，但試劑純度和 pH 敏感性會導致 AAV 生產(chǎn)批次間差異顯著。

在三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，質(zhì)粒分配比例的失衡會降低轉(zhuǎn)染效率，進而導致空衣殼比率出現(xiàn)明顯的批次差異。構建衣殼基因序列及其它生產(chǎn)相關基因序列穩(wěn)定整合的 AAV 包裝細胞系統(tǒng)，有望解決這一問題。

在生物制藥領域，實現(xiàn) AAV 規(guī)?；a(chǎn)，搭建穩(wěn)定且易放大的生產(chǎn)體系是工藝開發(fā)的重點之一。在如今藥物開發(fā)競爭的大環(huán)境下，構建這樣一套生產(chǎn)體系，需以耗費大量的人力成本、時間和金錢成本為代價，無疑加重企業(yè)和研發(fā)人員的負擔。

為助力行業(yè)突破 AAV 規(guī)模化生產(chǎn)的重重難關，2025 年 4 月 17 日（周四）19：00 - 20 ：30，醫(yī)麥客攜手翌圣生物和行誠生物共同推出的主題為「從質(zhì)粒到轉(zhuǎn)染：AAV規(guī)模化生產(chǎn)中的關鍵原料技術突破與合規(guī)性實戰(zhàn)經(jīng)驗分享」的直播課。

屆時，翌圣生物研發(fā)總監(jiān)滕以剛博士和行誠生物李軍輝博士將結合切身豐富的 AAV 生產(chǎn)項目經(jīng)歷，深度剖析 AAV 規(guī)?；a(chǎn)的質(zhì)粒制備、轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)的技術要點，助力大家突破技術瓶頸。歡迎大家積極報名！

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