脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）作為mRNA遞送的高效載體，由電離脂質(zhì)、磷脂、膽固醇和可脫落的PEG脂質(zhì)組成。mRNA-LNPs通過與載脂蛋白E（ApoE）結(jié)合，經(jīng)細(xì)胞膜上的ApoE受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，隨后電離脂質(zhì)促進(jìn)內(nèi)體逃逸，釋放mRNA至細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)外源蛋白的高效表達(dá)。目前，mRNA-LNPs的制備主要采用溶劑稀釋法，其中mRNA溶于酸性緩沖液，脂質(zhì)溶于有機(jī)溶劑后混合。乙醇是廣泛采用的有機(jī)溶劑，但其對mRNA-LNPs性能的影響尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究系統(tǒng)地探索了制備mRNA-LNPs過程中溶解脂質(zhì)的有機(jī)溶劑對其性質(zhì)和功能的影響。通過篩選多種有機(jī)溶劑，我們發(fā)現(xiàn)吡啶作為溶劑能夠顯著提升mRNA-LNPs的質(zhì)量和體外、體內(nèi)功能。吡啶適用于多種脂質(zhì)組合，并可兼容微流控制備技術(shù)。此外，經(jīng)過適當(dāng)純化后，mRNA-LNPs中殘留的吡啶量極低，不影響其安全性。盡管需進(jìn)一步機(jī)制研究，但本研究表明吡啶是一種比乙醇更適合用于mRNA-LNP生產(chǎn)的溶劑。材料與方法
1.1 材料：
本研究使用了多種脂質(zhì)成分，包括SM-102、Dlin-MC3-DMA、DOPC、DSPC、DOPE和DMG-PEG2000等。有機(jī)溶劑包括乙醇、甲醇、1-和2-丙醇、乙腈、DMF、DMSO、丙酮、吡啶、1,4-二氧六環(huán)、叔丁醇、四氫呋喃、嗎啉、4-甲基吡啶、吡咯烷、哌啶和膽固醇等。細(xì)胞系包括人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人肝癌細(xì)胞系HepG2。動物實(shí)驗(yàn)采用ddY雄性小鼠。
1.2 mRNA-LNPs的制備：
脂質(zhì)溶于有機(jī)溶劑中，mRNA溶于50 mM檸檬酸緩沖液（pH 3）中。通過渦旋或微流控設(shè)備混合脂質(zhì)和mRNA溶液，隨后進(jìn)行透析和超濾純化。通過測量mRNA的包封效率（EE）來評估LNPs的制備效果。1.3 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：
將編碼螢火蟲熒光素酶（fLuc）的mRNA-LNPs加入A549和HepG2細(xì)胞中，24小時后檢測熒光素酶表達(dá)水平。1.4 體內(nèi)評價：
通過尾靜脈注射fLuc編碼的mRNA-LNPs至小鼠體內(nèi)，6小時后檢測各器官中的熒光素酶表達(dá)水平。同時，監(jiān)測血液中Gluc編碼的mRNA-LNPs的表達(dá)水平以評估時間依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 有機(jī)溶劑對mRNA-LNPs理化性質(zhì)的影響：
在制備mRNA-LNPs的過程中，我們系統(tǒng)地探索了多種有機(jī)溶劑對LNPs理化性質(zhì)的影響。具體結(jié)果如下：粒徑（Size）：不同有機(jī)溶劑制備的mRNA-LNPs粒徑差異顯著。例如，在乙醇、甲醇、乙腈、DMF、DMSO、丙酮、二氧六環(huán)和嗎啉等溶劑中，mRNA-LNPs的粒徑通常在70-100 nm之間。然而，使用2-丙醇和吡啶作為溶劑時，LNPs的粒徑較大，分別為154.2 ± 10.0 nm和132.9 ± 7.5 nm。特別地，1-丙醇、叔丁醇、四氫呋喃、4-甲基吡啶、吡咯烷和哌啶等溶劑制備的LNPs粒徑超過200 nm，表明這些溶劑可能不適合用于mRNA-LNPs的制備。多分散指數(shù)（PDI）：PDI是衡量LNPs粒徑分布均勻性的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，使用吡啶制備的mRNA-LNPs具有較低的PDI值（0.11 ± 0.02），表明其粒徑分布高度均一。相比之下，乙醇制備的LNPs PDI值為0.24 ± 0.03，雖然也在可接受范圍內(nèi)，但略高于吡啶制備的LNPs。包封效率（EE）：幾乎所有測試的有機(jī)溶劑（如乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈、DMF、DMSO、丙酮、吡啶、二氧六環(huán)和嗎啉）都能實(shí)現(xiàn)接近100%的mRNA包封效率。然而，1-丙醇、叔丁醇、四氫呋喃、4-甲基吡啶、吡咯烷和哌啶等溶劑制備的LNPs包封效率顯著降低，表明這些溶劑可能不利于mRNA的穩(wěn)定包封。Table 1 Physicochemical properties of mRNA-LNPs prepared using different organic solvents.
2.2 有機(jī)溶劑對mRNA轉(zhuǎn)染效率的影響：為了評估不同有機(jī)溶劑制備的mRNA-LNPs的體外轉(zhuǎn)染效率，我們在A549和HepG2細(xì)胞系中進(jìn)行了螢火蟲熒光素酶（fLuc）表達(dá)實(shí)驗(yàn)。具體結(jié)果如下：A549細(xì)胞：與乙醇制備的mRNA-LNPs相比，吡啶制備的LNPs顯著提高了fLuc的表達(dá)水平（p < 0.001）。此外，隨著吡啶在混合溶劑（乙醇與吡啶）中比例的增加，fLuc表達(dá)水平也逐漸提高，并在吡啶比例為75%時達(dá)到平臺期。HepG2細(xì)胞：雖然吡啶制備的mRNA-LNPs在HepG2細(xì)胞中提高fLuc表達(dá)水平的趨勢不如A549細(xì)胞顯著，但仍表現(xiàn)出高于乙醇制備LNPs的轉(zhuǎn)染效率（p < 0.05）。Fig. 1. Effect of organic solvent dissolving lipid on the mRNA transfection efficiency of mRNA-LNPs.
為了驗(yàn)證吡啶作為溶劑的通用性，我們將其應(yīng)用于多種脂質(zhì)組合和微流控制備技術(shù)中。具體結(jié)果如下：
不同脂質(zhì)組合：吡啶適用于多種磷脂（如DOPC、DSPC、DOPE）和電離脂質(zhì)（如SM-102、ALC-0315、DLin-MC3-DMA）組合制備的mRNA-LNPs。盡管在某些組合中（如ALC-0315與吡啶組合），包封效率略有下降，但轉(zhuǎn)染效率仍顯著提高。
Fig. 2. Effect of pyridine concentration on the mRNA transfection efficiency of mRNA-LNPs. SM-102, phospholipids (DOPC, DSPC, or DOPE), cholesterol, and DMGPEG (50/10/38.5/1.5 (mol%)) were dissolved in a mixed organic solvent containing pyridine and ethanol at any proportions.Fig. 3. mRNA transfection efficiency of mRNA-LNPs prepared using ethanol or pyridine Ionizable lipids (SM-102, ALC-0315, or Dlin-MC3-DMA), DOPC, cholesterol, and DMG-PEG (50/10/38.5/1.5 (mol%)) were dissolved in ethanol or pyridine.Fig. 4. mRNA transfection efficiency of mRNA-LNPs prepared with microfluidics device. Ionizable lipids (SM-102, ALC-0315, or Dlin-MC3-DMA), DOPC, cholesterol and DMG-PEG were dissolved in ethanol or pyridine.為了評估吡啶制備的mRNA-LNPs在體內(nèi)的功能，我們通過尾靜脈注射fLuc編碼的LNPs至小鼠體內(nèi)，并檢測各器官中的熒光素酶表達(dá)水平。具體結(jié)果如下：器官分布：吡啶制備的mRNA-LNPs在肝臟、腎臟和肺中的fLuc表達(dá)水平顯著高于乙醇制備的LNPs（p < 0.05）。然而，在脾臟中，兩種LNPs的fLuc表達(dá)水平無顯著差異。時間依賴性：我們還監(jiān)測了血液中Gluc編碼的mRNA-LNPs的表達(dá)水平以評估其時間依賴性。結(jié)果顯示，吡啶制備的LNPs在注射后1-48小時內(nèi)Gluc表達(dá)水平顯著高于乙醇制備的LNPs（p < 0.05），且其曲線下面積（AUC）也更高。AST和ALT水平：注射mRNA-LNPs后，小鼠血漿中的AST和ALT水平均在正常范圍內(nèi)，且吡啶制備的LNPs與乙醇制備的LNPs之間無顯著差異。這表明吡啶制備的mRNA-LNPs具有良好的生物相容性和安全性。Fig. 5. In vivo evaluation of mRNA-LNPs prepared using ethanol or pyridine SM-102, DOPC, cholesterol, nd DMG-PEG were dissolved in either ethanol or pyridine. mRNA-LNPs were prepared using a microfluidic device.為了評估m(xù)RNA-LNPs中殘留的吡啶量是否影響其安全性，我們使用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）進(jìn)行了檢測。經(jīng)過適當(dāng)純化后，mRNA-LNPs中殘留的吡啶量極低，遠(yuǎn)低于國際協(xié)調(diào)會議（ICH）指南規(guī)定的最大允許閾值200 ppm。這表明吡啶在mRNA-LNP制備過程中的使用是安全的，不會因殘留溶劑而影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。Fig. 6. Residual pyridine in mRNA-LNPs prepared using pyridine SM-102, DOPC, cholesterol, and DMG-PEG were dissolved in pyridine.討論
本研究創(chuàng)新性地系統(tǒng)地探索了制備mRNA-LNPs過程中溶解脂質(zhì)的有機(jī)溶劑對其性質(zhì)和功能的影響。吡啶作為溶劑能夠顯著提升mRNA-LNPs的質(zhì)量和轉(zhuǎn)染效率，這可能與其對脂質(zhì)溶解性和混合過程中pH值的影響有關(guān)。盡管吡啶制備的mRNA-LNPs粒徑較大，但其高度均一性和高效轉(zhuǎn)染效率表明其在mRNA遞送系統(tǒng)中的巨大潛力。此外，吡啶的通用性和微流控制備兼容性進(jìn)一步擴(kuò)展了其在mRNA-LNP生產(chǎn)中的應(yīng)用前景。安全性評價結(jié)果表明，吡啶制備的mRNA-LNPs具有良好的生物相容性，殘留的吡啶量遠(yuǎn)低于安全安全閾值。然而，本研究尚未揭示吡啶提升mRNA-LNP功能的具體機(jī)制。未來的研究將進(jìn)一步探索吡啶對mRNA-LNP微結(jié)構(gòu)的影響，以及其在不同遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用潛力。結(jié)論
本研究表明，吡啶作為溶解脂質(zhì)的有機(jī)溶劑能夠顯著提升mRNA-LNPs的質(zhì)量和體外、體內(nèi)功能。吡啶制備的mRNA-LNPs具有高度均一性和高效轉(zhuǎn)染效率，且適用于多種脂質(zhì)組合和微流控制備技術(shù)。經(jīng)過適當(dāng)純化后，mRNA-LNPs中殘留的吡啶量極低，不影響其安全性。盡管需進(jìn)一步機(jī)制研究，但吡啶作為一種比乙醇更適合用于mRNA-LNP生產(chǎn)的溶劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。
參考文獻(xiàn)：Ogawa, Koki, et al. "Choice of organic solvent affects function of mRNA-LNP; pyridine produces highly functional mRNA-LNP." International Journal of Pharmaceutics 673 (2025): 125367.
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