流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中如何選擇合適的抗體？

在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中，熒光抗體會直接影響著實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量，來聊聊抗體選擇的小技巧：

1）確定抗體基本信息

確定檢測的指標(biāo)，目的細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記或胞內(nèi)標(biāo)記；

根據(jù)檢測樣本種屬選擇可適用抗體；

根據(jù)抗體說明書，明確可用于流式實(shí)驗(yàn)。

2）確定儀器的參數(shù)配置

激光器：不同流式細(xì)胞儀激光器不同，常見的有405nm，488nm和635nm。

濾光片：檢測通道數(shù)量決定可以同時(shí)檢測的指標(biāo)數(shù)，所選擇熒光素要在儀器的可檢測范圍內(nèi)。

儀器：相同熒光在不同儀器上檢測通道可能不同，需要參照儀器說明。

3）熒光素的選擇

抗原表達(dá)弱或分群不明顯的建議選擇強(qiáng)熒光，如PE、APC。

抗原表達(dá)強(qiáng)或分群明顯的建議選擇*常用的弱熒光例如FITC。

常用熒光強(qiáng)弱排序?yàn)椋篜E>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC

4）多色熒光搭配

同時(shí)檢測幾個指標(biāo)時(shí)，需要多熒光標(biāo)記進(jìn)行搭配。

注意所使用的儀器有哪些激光，各通道之間的熒光素可以隨意搭配，檢測通道不能沖突。

如需要做多個指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀能檢測的通道不夠，可將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別進(jìn)行檢測。

所選熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少，否則將會導(dǎo)致較大的補(bǔ)償。

5）同型對照抗體的選擇

同型對照，是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，類似于陰性對照，是流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)*可*缺的一項(xiàng)。

同型對照是與一抗相同種屬來源、相同亞型及亞鏈、相同熒光標(biāo)記的免疫球蛋白，也要求使用相同劑量。

如果同型對照的表達(dá)會比抗體的表達(dá)高，首先檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類似的抗原非常多，那么同型對照非特異性的結(jié)合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現(xiàn)象。這個時(shí)候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。

6）直接法與間接法染色的選擇

直接法：即使用直接偶聯(lián)抗體，可直接多重分析來自同一宿主的抗體。實(shí)驗(yàn)步驟更快，并且能夠在一項(xiàng)檢測中使用許多不同的抗體，從而能夠同時(shí)讀取大量終點(diǎn)。

間接法：即使用非偶聯(lián)一抗 + 偶聯(lián)二抗，可改善以低豐度存在的靶標(biāo)的檢測，由于二次放大可提供更高的靈敏度。