Induction of reactive oxygen species by mechanical stretch drives endothelin production in neonatal pig renal epithelial cells

Keywords: Acute kidney injury; Endothelin; Endothelin converting enzyme; Hydrogen peroxide; Mechanical stretch; Neonatal pigs; Urinary tract obstruction.

從腎臟到尿道的尿路梗阻是嬰兒腎損傷的重要原因。長(zhǎng)期梗阻可能發(fā)展為嚴(yán)重的腎臟炎癥、纖維化和慢性腎病。尿路梗阻導(dǎo)致腎內(nèi)皮素（ET）1 水平升高，提示腎臟 ET1 可能導(dǎo)致梗阻性腎病。ET有三種不同的異構(gòu)體（ET1、ET2和ET3）。血管活性 ET 異構(gòu)體是由 ET 轉(zhuǎn)化酶（ECE）誘導(dǎo)的前分子大 ET 蛋白水解加工為生物活性肽產(chǎn)生的。ECE1 主要在腎小管區(qū)域表達(dá)。H2O2是一種活性氧（ROS），可反式激活 ECE1 的啟動(dòng)子并增加其水平。尿路梗阻導(dǎo)致顯著的 ROS 生成和腎小管細(xì)胞的伸展。研究還表明，機(jī)械拉伸是細(xì)胞氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)的有效驅(qū)動(dòng)因素，但腎小管細(xì)胞拉伸是否刺激 ROS 和下游 ET 的產(chǎn)生尚未明確。

ET 同源受體（ETR）與 G 蛋白偶聯(lián)，它們的刺激導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞（SMC）離子通道激活并隨之控制細(xì)胞內(nèi) Ca2+（[Ca2+]i）水平和血管反應(yīng)性。ET1 通過激活平滑肌細(xì)胞TRPC3 收縮腦動(dòng)脈，但血管調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)機(jī)制存在區(qū)域異質(zhì)性。研究表明，TRPC3 介導(dǎo)新生豬腎微血管 SMC 中的受體操縱的鈣內(nèi)流（ROCE）。然而，盡管對(duì)其他血管床進(jìn)行了大量工作，但腎微血管 SMC 中 TRP 通道的病理生理學(xué)知之甚少。

嚙齒類動(dòng)物梗阻性腎病的治療尚未轉(zhuǎn)化為人類的成功臨床結(jié)果。因此，需要新的途徑和動(dòng)物模型來確定梗阻性急性腎損傷（AKI）的早期機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)，以防止嬰兒腎損失。然而，由于人類和豬的腎臟系統(tǒng)在解剖和功能上相似，豬模型可能比嚙齒動(dòng)物更能模擬人類梗阻性腎病的病理生理學(xué)。機(jī)械拉伸培養(yǎng)的腎上皮細(xì)胞是單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導(dǎo)的腎小管應(yīng)激的體外模型。

基于此，美國(guó)田納西大學(xué)健康科學(xué)中心醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)研究中使用了新生豬腎上皮細(xì)胞系和短期 UUO 模型，以驗(yàn)證拉伸驅(qū)動(dòng)的 ROS 刺激新生兒腎臟中 ET 產(chǎn)生，導(dǎo)致下游腎臟血管收縮的假設(shè)。研究成果發(fā)表于 Redox Biology 期刊題為“Induction of reactive oxygen species by mechanical stretch drives endothelin production in neonatal pig renal epithelial cells”。

ECE1 和 ET1 異構(gòu)體主要在豬腎細(xì)胞系 LLC-PK1 細(xì)胞和整個(gè)新生豬腎臟中表達(dá)。為了調(diào)查 H2O2是否刺激 LLC-PK1 細(xì)胞中 ECE1 的產(chǎn)生，使用葡萄糖氧化酶（GOD）持續(xù)生成H2O2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GOD 處理后細(xì)胞 H2O2 產(chǎn)生和ECE1 水平增加，GOD 還增加了細(xì)胞中ET1-3 水平和 panET 免疫染色。這說明，H2O2誘導(dǎo) LLC-PK1 細(xì)胞產(chǎn)生 ECE1-依賴性 ET1-3。

如 f-肌動(dòng)蛋白免疫染色所示，10% 循環(huán)單軸機(jī)械拉伸的 LLC-PK1 細(xì)胞比未拉伸的細(xì)胞更長(zhǎng)（圖1 A）。qRT-PCR 顯示，在拉伸的 LLC-PK1 細(xì)胞中，NOX2 和 NOX4 mRNAs 分別增加了 4 倍和 2 倍（圖1 B、C）。拉伸后的細(xì)胞顯示過氧化氫酶免疫染色顯著降低，細(xì)胞 H2O2  增加（圖1 D-F）。拉伸誘導(dǎo)的細(xì)胞 H2O2 和ECE1 增加被 EUK（一種超氧化物歧化酶和過氧化氫酶模擬物）逆轉(zhuǎn)（圖1 F、G）。拉伸細(xì)胞中的 ET1-3 水平也增加，而 EUK 和 ECE1 抑制劑 CGS 使其減弱（圖1 H-J）。NOX 抑制劑 apocynin 也減少了拉伸誘導(dǎo)的 ECE1 和 ET1-3 的產(chǎn)生。此外，siRNA 介導(dǎo)的 NOX2 和 NOX4 敲低同樣減弱了拉伸誘導(dǎo)的 ECE1 和 ET1-3。這些數(shù)據(jù)表明，機(jī)械拉伸在 LLC-PK1 細(xì)胞中產(chǎn)生 H2O2并誘導(dǎo) ECE1-依賴性 ET1-3 產(chǎn)生。

圖1     機(jī)械拉伸在 LLC-PK1 細(xì)胞中產(chǎn)生 H2O2并誘導(dǎo) ECE1-依賴性 ET1-3 產(chǎn)生。

阻塞左輸尿管 3 小時(shí)后恢復(fù) 3 小時(shí)，未導(dǎo)致新生豬出現(xiàn)明顯的形態(tài)性腎損傷。然而，急性可逆性 UUO（rUUO）增加了豬尿異前列腺素（腎氧化應(yīng)激標(biāo)志物）和 H2O2水平，但降低過氧化氫酶的免疫染色。IHC 顯示，ECE1 在腎小管中表達(dá)，其被 rUUO 擴(kuò)增。 rUUO 后 mRNA 表達(dá)、腎組織中的酶活性和尿液 ECE1 的水平高于對(duì)照組。rUUO 豬的腎小管免疫染色和 ET1-3 水平升高，而CGS 逆轉(zhuǎn)了這一點(diǎn)。這說明，急性可逆性 UUO 刺激新生豬腎臟中 H2O2產(chǎn)生和 ECE1-依賴性 ET1-3 產(chǎn)生。

在沒有細(xì)胞外 Ca2+ 的情況下，ET 沒有增加新生豬入球小動(dòng)脈中 [Ca2+]i 水平（圖2 A、B）。細(xì)胞外 Ca2+ 的恢復(fù)導(dǎo)致 ET 誘導(dǎo)的 [Ca2+]i 增加約150 nM（圖2 A、B）。ROCE 激活劑 DAG 類似物 OAG 顯著升高微血管中的 [Ca2+]i，選擇性 TRPC3 阻斷劑 Pyr3 則減弱 [Ca2+]i（圖2 C、D）。盡管尼莫地平阻斷L-型電壓門控式Ca2+ 通道（L-VGCC），他普西加金耗竭細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 貯存，但激活 ETR還是能夠提高 [Ca2+]i水平（圖2 E、F）。雖然選擇性 TRPC6 通道阻滯劑 SAR 7334 沒有效果，但 Pyr3 基本上消除了 ET1 誘導(dǎo)的 ROCE。將 ET1-3 直接輸注到腎臟中以盡量減少其全身影響，導(dǎo)致腎皮質(zhì)灌注和總腎血流量（tRBF）減少，腎血管阻力（RVR）增加，而這些被 Pyr3 減弱。這些數(shù)據(jù)表明，ET 受體（ETR）的激活觸發(fā)了入球小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中受體操控式Ca2+ 內(nèi)流（ROCE），并通過 TRPC3 通道導(dǎo)致腎臟灌注不足。

圖2   ET 受體（ETR）的激活觸發(fā)了入球小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中ROCE。

此外，結(jié)果顯示，假手術(shù)豬的 tRBF 和 RVR 保持不變。相比之下，在 UUO 期間，tRBF 降低，RVR 增加，并且盡管去除了阻塞，但仍未恢復(fù)。用 CGS、ETR 拮抗劑波生坦和 pyr3  處理則逆轉(zhuǎn)了 rUUO 誘導(dǎo)的 tRBF 降低和 RVR 增加。這說明，rUUO 通過激活 ECE1/ETR/TRPC3引起腎臟灌注不足。

從新生豬腎微血管中分離的蛋白，用抗-ETRA、ETRB和TRPC3抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示急性rUUO豬體內(nèi)這些蛋白的表達(dá)沒有改變（圖3 A-C）。rUUO 增加了尿液早期 AKI 生物標(biāo)志物 NGAL、L-FABP 和 IL-18 的水平（圖3 D-F）。rUUO 誘導(dǎo)的這些生物標(biāo)志物的增加被 CGS、波生坦和 Pyr3 逆轉(zhuǎn)（圖3 D-F）。這些數(shù)據(jù)表明，rUUO 未改變 ETR和 TRPC3 的蛋白表達(dá)水平，但通過激活 ECE1/ETR/TRPC3 信號(hào)誘導(dǎo)早期 AKI。

圖3    rUUO 未改變 ETR和 TRPC3 的蛋白表達(dá)水平，但通過激活 ECE1/ETR/TRPC3 信號(hào)誘導(dǎo)早期 AKI。

圖4    機(jī)械拉伸通過誘導(dǎo)多種 ET 異構(gòu)體的 ROS-依賴性生物合成和血管 SMC ET 受體和 TRPC3 通道的連續(xù)激活，損害新生豬微循環(huán)并促進(jìn)早期腎功能不全的假設(shè)途徑。

盡管先前的研究表明，新生兒尿路梗阻會(huì)增加腎臟 ET1 水平，但對(duì)梗阻腎臟中的拉伸應(yīng)力-ET 分子的聯(lián)系知之甚少。這項(xiàng)研究提供了新的數(shù)據(jù)，表明拉伸驅(qū)動(dòng)的氧自由基刺激新生豬腎上皮細(xì)胞中所有 ET 異構(gòu)體的產(chǎn)生。ET 激活腎血管 SMC TRPC3，導(dǎo)致持續(xù)性血管收縮和 RVR 增加。這些機(jī)制可能導(dǎo)致尿路梗阻引起的新生兒 AKI 的早期血管變化。

參考文獻(xiàn)：Kumar R, Soni H, Afolabi JM, Kanthakumar P, Mankuzhy PD, Iwhiwhu SA, Adebiyi A. Induction of reactive oxygen species by mechanical stretch drives endothelin production in neonatal pig renal epithelial cells. Redox Biol. 2022 Sep;55:102394. doi: 10.1016/j.redox.2022.102394. Epub 2022 Jul 4. PMID: 35841629; PMCID: PMC9289874.

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