本文要點(diǎn)：通過(guò)檢測(cè)染料標(biāo)記的白蛋白，可在體內(nèi)滲入腦實(shí)質(zhì)來(lái)可視化血腦屏障（BBB）破壞。盡管伊文思藍(lán)（EB）和吲哚菁綠（ICG）染料已被用于評(píng)估BBB損傷，但它們的可見(jiàn)光或近紅外一區(qū)（NIR-I）成像窗口，限制了這種 “白蛋白基礎(chǔ)”策略的成像靈敏度和對(duì)比度。在此，本文構(gòu)建了一種針對(duì)白蛋白的近紅外二區(qū)（NIR-II）特異性標(biāo)記探針，作為發(fā)色團(tuán)用于在中風(fēng)中構(gòu)建熒光蛋白以評(píng)估BBB破壞。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的發(fā)色團(tuán)C7-1080可以通過(guò)親核取代與白蛋白共價(jià)結(jié)合，無(wú)需佐劑即可形成熒光蛋白。同時(shí)白蛋白通過(guò)緊密的夾持效應(yīng)，有效增強(qiáng)發(fā)色團(tuán)的亮度并增強(qiáng)其穩(wěn)定性。通過(guò)理論模擬、蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)突變技術(shù)研究白蛋白與發(fā)色團(tuán)之間的結(jié)合行為。原位NIR-II熒光蛋白構(gòu)建策略聯(lián)合IR-808Ac探針，有助于在缺血性中風(fēng)期間對(duì)BBB破壞和腦血管實(shí)現(xiàn)高精度雙通道成像。總體而言，這種原位白蛋白特異性標(biāo)記為診斷和監(jiān)測(cè)中風(fēng)提供了新工具，有望用于研究相關(guān)疾病的進(jìn)展和治療反應(yīng)。

熒光蛋白，活體熒光成像技術(shù)

在本文中，研究者應(yīng)用分子側(cè)基工程策略進(jìn)一步優(yōu)化染料結(jié)構(gòu)，使其具有選擇性的白蛋白標(biāo)記特性。體外結(jié)果證實(shí)，作為發(fā)色團(tuán)的NIR-II白蛋白靶向染料（C7-1080）能夠在室溫或生理溫度下，無(wú)需任何催化劑，與人血清白蛋白（HSA）疏水腔中的半胱氨酸發(fā)生親核取代反應(yīng)，完成位點(diǎn)特異性共價(jià)結(jié)合，從而形成NIR-II FPs。值得注意的是，作為外殼的HSA通過(guò)緊密夾持效應(yīng)增強(qiáng)了發(fā)色團(tuán)的亮度和光穩(wěn)定性。更重要的是，由染料與可靠的白蛋白相互作用原位生成的NIR-II FPs為中風(fēng)中血腦屏障（BBB）破壞的精確定位提供了可能（方案1）。這項(xiàng)工作從仿生的角度為原位NIR-II FPs的構(gòu)建提供了概念驗(yàn)證，有望為中風(fēng)相關(guān)疾病的研究提供一種強(qiáng)大的技術(shù)工具。

圖1. 篩選和表征具有最佳NIR-II亮度的Cn-1080染料

根據(jù)研究者之前對(duì)染料結(jié)構(gòu)與外源性白蛋白結(jié)合能力的研究，選擇了1080染料骨架結(jié)構(gòu)作為構(gòu)建原位NIR-II FPs的發(fā)色團(tuán)候選（圖1a）。隨后，利用分子側(cè)基工程策略對(duì)Cn-1080染料的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化，以篩選出具有優(yōu)異光學(xué)性能和高效白蛋白標(biāo)記性能的NIR-II發(fā)色團(tuán)。如圖1b-d所示，NIR-II亮度、紫外吸收和熒光數(shù)據(jù)一致表明，羧基側(cè)鏈的長(zhǎng)度直接影響了Cn-1080染料的光學(xué)性能。C7-1080染料分子展現(xiàn)了更優(yōu)的NIR-II亮度和光穩(wěn)定性，遠(yuǎn)超臨床批準(zhǔn)的ICG探針（圖1e）。

研究者利用分子動(dòng)力學(xué)方法模擬了不同Cn-1080染料的最佳構(gòu)象，并對(duì)其分子振動(dòng)進(jìn)行了定量分析。如圖1f所示，不同Cn-1080染料的側(cè)鏈呈現(xiàn)出不同的最佳構(gòu)象，兩個(gè)羧基傾向于“手拉手”形成分子內(nèi)氫鍵以限制分子振蕩。特別是，側(cè)鏈長(zhǎng)度最為合適的C7-1080染料分子能夠最小化端基擺動(dòng)，減少扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT）的發(fā)生，從而展現(xiàn)出更為出色的發(fā)光能力（圖1g-i）。同時(shí)，研究者還利用密度泛函理論計(jì)算了不同Cn-1080染料的最高占據(jù)分子軌道（HOMO）和蕞低未占據(jù)分子軌道（LUMO）（圖1j）。高斯計(jì)算結(jié)果顯示，側(cè)鏈長(zhǎng)度幾乎不影響Cn-1080染料的帶隙，因此相應(yīng)的峰值沒(méi)有明顯的藍(lán)移或紅移。上述結(jié)果有效證實(shí)了Cn-1080染料的發(fā)光調(diào)節(jié)機(jī)制源于羧基側(cè)鏈對(duì)分子骨架扭轉(zhuǎn)的有效限制。綜上所述，C7-1080染料有望成為構(gòu)建熒光蛋白的NIR-II發(fā)色團(tuán)候選。

本文進(jìn)一步詳細(xì)研究了Cn-1080染料在體內(nèi)的白蛋白標(biāo)記行為。如圖2所示，血管造影和體內(nèi)代謝成像表明，與其它Cn-1080系列染料相比，尾靜脈注射后，C7-1080染料展現(xiàn)出更顯著的熒光信號(hào)和信噪比。同時(shí)代謝數(shù)據(jù)也證實(shí)，Cn-1080系列染料具有優(yōu)異的體內(nèi)排泄能力，在尾靜脈注射72小時(shí)后幾乎無(wú)熒光信號(hào)殘留。

為了深入了解體內(nèi)成像差異的原因，研究者進(jìn)一步分析了Cn-1080與全血（WB）以及小鼠血清（MS）的結(jié)合行為（圖2b）。WB@Cn-1080和MS@Cn-1080復(fù)合物的NIR-II亮度和凝膠電泳數(shù)據(jù)均表明，C7-1080在體內(nèi)展現(xiàn)出最佳的白蛋白熒光標(biāo)記能力。此外，如圖2g所示，對(duì)注射C7-1080染料的小鼠全血進(jìn)行離心分析發(fā)現(xiàn)，C7-1080染料優(yōu)先與血清中的白蛋白共價(jià)結(jié)合，而非血漿，從而在原位形成NIR-II熒光蛋白（圖2h,i）?？傮w而言，這些研究表明C7-1080可作為白蛋白的熒光標(biāo)記物，用于原位構(gòu)建熒光蛋白。

圖3. 使用原位白蛋白標(biāo)記染料對(duì)血腦屏障（BBB）破壞進(jìn)行靶向成像

血腦屏障（BBB）的特點(diǎn)是血液與腦實(shí)質(zhì)之間具有高度選擇性通透性。正常情況下，白蛋白在腦組織中很少見(jiàn)。然而，在中風(fēng)或創(chuàng)傷事件后，血液可通過(guò)受損的BBB滲入腦實(shí)質(zhì)，導(dǎo)致局部白蛋白水平急劇上升。因此，開(kāi)發(fā)能與內(nèi)源性白蛋白特異性原位結(jié)合的NIR-II探針，有望為監(jiān)測(cè)BBB破壞提供更好的成像工具。

得益于C7-1080染料與白蛋白之間可靠的相互作用，本文不僅能夠直接觀察白蛋白的泄漏，還有望在中風(fēng)期間精確定位BBB的破壞部位。如圖3a所示，研究者成功建立了光栓塞中風(fēng)（PTS）模型，位于小鼠左側(cè)大腦皮層的梗死區(qū)域。如圖3b-d所示，先從尾靜脈注射C7-1080染料，驗(yàn)證NIR-II FPs在體內(nèi)的形成及藥代動(dòng)力學(xué)特征。血液亮度、凝膠電泳和蛋白染色有效證實(shí)了熒光蛋白在體內(nèi)的形成，并具有持續(xù)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，為靶向成像BBB破壞奠定了基礎(chǔ)。如圖3e,f所示，與假手術(shù)組相比，熒光信號(hào)在中風(fēng)區(qū)域逐漸累積，早在10分鐘就檢測(cè)到泄漏，表明其通過(guò)受損的BBB滲入腦實(shí)質(zhì)。相比之下，由于白蛋白逃逸的NIR探針（IR-808Ac）與白蛋白無(wú)共價(jià)結(jié)合，其在體內(nèi)的快速肝清除和短循環(huán)時(shí)間導(dǎo)致其無(wú)法對(duì)中風(fēng)中的BBB破壞進(jìn)行成像。此外，研究者通過(guò)調(diào)節(jié)光栓塞時(shí)間建立不同程度的中風(fēng)模型，以評(píng)估C7-1080染料監(jiān)測(cè)BBB破壞的靈敏度。令人鼓舞的是，即使在光栓塞時(shí)間為1分鐘的輕度癥狀中風(fēng)模型中，C7-1080染料仍展現(xiàn)出良好的BBB破壞檢測(cè)效果。如圖3g,h所示，TTC和EB染色區(qū)域與NIR-II熒光成像區(qū)域基本一致。這些結(jié)果表明，基于PTS方法的腦缺血中風(fēng)會(huì)導(dǎo)致BBB損傷/破壞，使血漿成分滲入腦實(shí)質(zhì)。上述現(xiàn)象有效表明，C7-1080染料突出的原位白蛋白標(biāo)記能力是其實(shí)現(xiàn)對(duì)BBB破壞敏感和特異性成像的直接原因。

為了更深入地了解BBB損傷區(qū)域周?chē)郝窂降淖兓x擇了另一種白蛋白逃逸的NIR探針（IR-808Ac），其在808 nm處具有最佳激發(fā)性，用于中風(fēng)小鼠的腦血管可視化。研究者隨后分別在兩個(gè)不同的成像通道下捕獲了BBB泄漏（1064 nm激發(fā)，C7-1080）和腦血管系統(tǒng)動(dòng)態(tài)變化（808 nm激發(fā)，IR-808Ac）的NIR-II圖像。結(jié)果顯示，IR-808Ac不僅能夠清晰、動(dòng)態(tài)地描繪出缺血性中風(fēng)期間血流路徑的變化和恢復(fù)，還能實(shí)時(shí)區(qū)分動(dòng)靜脈血管。值得注意的是，雙通道成像顯示，在BBB損傷區(qū)域幾乎未見(jiàn)血管被照亮。中風(fēng)后的實(shí)時(shí)血管造影顯示，損傷部位附近的血供暫時(shí)喪失，隨后恢復(fù)，缺血區(qū)域隨著時(shí)間的推移逐漸形成損傷區(qū)域。同時(shí)，雙通道成像也有效地表明，缺血性中風(fēng)成像的本質(zhì)是通過(guò)標(biāo)記白蛋白流經(jīng)BBB破壞區(qū)域，從血管滲入腦實(shí)質(zhì)。

基于分子側(cè)鏈工程策略，本文提出了一類(lèi)具有亮近紅外二區(qū)（NIR-II）發(fā)光和白蛋白特異性共價(jià)標(biāo)記能力的染料分子（Cn-1080），作為原位構(gòu)建熒光蛋白的NIR-II發(fā)色團(tuán)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，C7-1080發(fā)色團(tuán)無(wú)需額外輔助即可與白蛋白（如人血清白蛋白HSA）通過(guò)親核取代反應(yīng)實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性共價(jià)結(jié)合，原位形成NIR-II熒光蛋白。特別是作為熒光蛋白外殼的HSA，通過(guò)緊密夾持效應(yīng)，增強(qiáng)了發(fā)色團(tuán)的亮度并調(diào)節(jié)了其穩(wěn)定性。發(fā)色團(tuán)與白蛋白的相互作用產(chǎn)生的原位NIR-II熒光蛋白，不僅可以直觀地顯示白蛋白的泄漏，還能高精度地對(duì)缺血性中風(fēng)中的血腦屏障（BBB）破壞進(jìn)行成像。通過(guò)與白蛋白逃逸探針IR-800Ac的有效結(jié)合，還實(shí)現(xiàn)了BBB破壞和腦血管的實(shí)時(shí)雙通道成像，為理解缺血性中風(fēng)的機(jī)制提供了新的視角?？傮w而言，這種原位熒光蛋白構(gòu)建策略有望彌補(bǔ)當(dāng)前NIR-II熒光蛋白的局限性，并為中風(fēng)相關(guān)疾病的研究帶來(lái)新的機(jī)遇。

參考文獻(xiàn)

Xu J, Du Y, Zhu N, et al. NIR-II Fluorescent Protein Created by In Situ Albumin-Tagging for Sensitive and Specific Imaging of Blood-Brain Barrier Disruption[J]. Advanced sScience, 2025.

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