（一）血管類器官的誘導(dǎo)與培養(yǎng)步驟

1. 多能干細(xì)胞培養(yǎng)

1.1 細(xì)胞系：使用人類胚胎干細(xì)胞（hESC）系 H9（來自 WiCell）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）系 NC8。

1.2 培養(yǎng)條件：

    - 在化學(xué)定義的無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)，定期檢測支原體污染，確保為陰性。

    - NC8 和 H9 細(xì)胞在 E8 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿預(yù)先用 165 µg/ml 無血清基質(zhì)（GFR Matrigel）包被。

    - mTagRFPT-CAAX WTC 和 iCRISPR 409-B2 細(xì)胞在 mTesR Plus 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿預(yù)先用 hESC 質(zhì)量級 Corning Matrigel 矩陣包被。

    - 每天更換培養(yǎng)基，用 0.5 mM EDTA 在磷酸鹽緩沖液（DPBS）中傳代。

 2. 血管類器官（hBVO）生成

2.1 細(xì)胞聚集：

    - 用 TrypLE 處理細(xì)胞，收集后離心，重懸于聚集培養(yǎng)基（KnockOut DMEM/F12、20% KnockOut 血清替代品、1% GlutaMAX、1% 非必需氨基酸、55 µM β-巰基乙醇、100 U/ml 青霉素 - 鏈霉素、50 µm Y-27632）。

    - 將細(xì)胞以 100 - 300 細(xì)胞 / 微孔的密度接種于 Corning Elplasia 圓底超低附著培養(yǎng)皿中。

    - 形成直徑 50 - 100 µm 的聚集體后，更換為 N2B27 培養(yǎng)基（Neurobasal : DMEM/F12 1:1、1% B27 補(bǔ)充劑、0.5% N2 補(bǔ)充劑、0.5% GlutaMAX、55 µM β-巰基乙醇、100 U/ml 青霉素 - 鏈霉素），并添加 12 µM CHIR99021 和 30 ng/ml BMP4。

2.2 中胚層誘導(dǎo)及分化：

    - 第 3 天，更換為含 2 µm Forskolin 和 100 ng/ml VEGF-A 的 N2B27 培養(yǎng)基。

    - 第 5 天，將聚集體嵌入 Collagen I-Matrigel 溶液（由 11.3% v/v 0.1 N NaOH、4.7% v/v 10X DMEM、0.9% v/v HEPES 緩沖液、0.7% v/v NaHCO3、0.5% v/v GlutaMAX、6.9% v/v Ham’s F12、50% v/v PureCol、25% v/v GFR Matrigel 組成，pH 7.4）中，轉(zhuǎn)移到 12 孔板中。

    - 從此時起，血管網(wǎng)絡(luò)和類器官在 BVO 培養(yǎng)基（StemPro-34 SFM 培養(yǎng)基，添加 StemPro-34 營養(yǎng)補(bǔ)充劑、1% GlutaMAX、100 U/ml 青霉素 - 鏈霉素、15% 胎牛血清、100 ng/ml VEGF-A 和 100 ng/ml FGF2）中培養(yǎng)，每 2 - 3 天更換新鮮培養(yǎng)基。

    - 第 10 天，將含有血管網(wǎng)絡(luò)的凝膠置于培養(yǎng)皿蓋上，在立體顯微鏡下用 27G 針頭手動切取單個血管類器官，轉(zhuǎn)移到 96 孔超低附著培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

（二）血管類器官疾病建模及移植步驟

1. 基因編輯

    - 利用CRISPR/Cas9技術(shù)對多能干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，引入與血管疾病相關(guān)的突變。

    - 將編輯后的細(xì)胞進(jìn)行篩選和擴(kuò)增，獲得穩(wěn)定表達(dá)突變基因的細(xì)胞系。

2. 類器官誘導(dǎo)與培養(yǎng): 按照上述血管類器官的誘導(dǎo)與培養(yǎng)步驟，從基因編輯后的多能干細(xì)胞中誘導(dǎo)形成血管類器官。

3. 疾病表型分析

    - 通過免疫熒光染色、基因表達(dá)分析等方法，檢測類器官中與疾病相關(guān)的分子和細(xì)胞表型。

    - 觀察血管類器官的形態(tài)、功能以及細(xì)胞間的相互作用，評估疾病模型的相似性和可靠性。

4. 藥物篩選與驗證

    - 將不同藥物添加到疾病模型類器官的培養(yǎng)基中，觀察藥物對疾病表型的影響。

    - 通過高通量篩選技術(shù)，快速評估多種藥物的療效和潛在機(jī)制。

5. 移植模型評估

    - 將攜帶疾病突變的血管organoids 到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察其在體內(nèi)的生長、分化和功能。

    - 通過組織學(xué)分析和功能測試，評估移植后類器官的成熟度和疾病相關(guān)表型。

（三）原作者重要研究結(jié)論

Marina T. Nikolova et al.cell. 2025 Apr 16:S0092-8674(25)00387-3.

通過多種實驗技術(shù)，對人血管類器官（hBVO）的發(fā)育進(jìn)行深入研究，在糖尿病模型、腦血管研究等方面取得重要結(jié)論，為理解血管發(fā)育和相關(guān)疾病機(jī)制提供關(guān)鍵依據(jù)。

 1. hBVO發(fā)育過程中的細(xì)胞命運(yùn)和狀態(tài)轉(zhuǎn)變：研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，詳細(xì)解析hBVO發(fā)育軌跡。發(fā)現(xiàn)從多能干細(xì)胞開始，經(jīng)側(cè)板中胚層階段，細(xì)胞逐漸分化為內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞。其中，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育存在兩個分支，早期內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）在第4天出現(xiàn)，其ETV2表達(dá)峰值明顯，之后逐漸分化，而晚期EPCs主要出現(xiàn)在第14 - 21天，且不表達(dá)ETV2 。同時，研究還證實了hBVO壁細(xì)胞具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞的潛能，豐富了對血管細(xì)胞發(fā)育的認(rèn)知。 

2. 糖尿病模型：文中構(gòu)建hBVO模擬糖尿病血管病變。研究表明，hBVO在模擬糖尿病環(huán)境下，血管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成發(fā)生顯著變化，與體內(nèi)糖尿病血管病變特征相似。通過對相關(guān)信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF和Notch信號通路對hBVO的發(fā)育和血管生成至關(guān)重要。在糖尿病狀態(tài)下，這些信號通路的異常激活或抑制，會影響內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖和血管的穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致血管功能障礙。這為深入研究糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制提供了重要的體外模型，有助于開發(fā)針對糖尿病血管并發(fā)癥的治療策略 。 

• 在模擬糖尿病環(huán)境下，hBVO 的血管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成出現(xiàn)與體內(nèi)糖尿病血管病變相似的顯著變化，且 VEGF 和 Notch 等信號通路異常。這啟示我們，深入探究這些信號通路的具體調(diào)控機(jī)制，明確它們在糖尿病血管病變中的關(guān)鍵節(jié)點，將有助于揭示糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病根源，為開發(fā)精準(zhǔn)治療策略提供理論支撐。例如，針對 VEGF 和 Notch 信號通路的異常變化，可以研發(fā)特異性的抑制劑或激活劑，精準(zhǔn)干預(yù)病變過程，從而改善血管功能 。
  
  
• 人血管類器官hBVO 作為有效的體外模型，可用于評估潛在藥物對糖尿病血管病變的治療效果。在實驗中，通過觀察藥物處理后 hBVO 血管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能的變化，能夠快速篩選出具有治療潛力的藥物，大大提高藥物研發(fā)的效率。以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物篩選為例，可在 hBVO 模型上測試不同藥物對內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖和血管生成的影響，挑選出的藥物進(jìn)行進(jìn)一步研究和臨床試驗，縮短藥物研發(fā)周期，降低研發(fā)成本 。

3. 腦血管研究：在腦血管研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)hBVO內(nèi)皮細(xì)胞與人類胎兒胰腺的內(nèi)皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組上最為相似，但與腦內(nèi)皮細(xì)胞存在差異。盡管如此，與腦海綿狀毛細(xì)血管畸形相關(guān)的基因在hBVO內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)高于胎兒小腦或大腦的內(nèi)皮細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)暗示，hBVO在模擬腦血管疾病方面具有一定潛力，同時也表明，雖然hBVO與腦內(nèi)皮細(xì)胞存在差異，但某些疾病相關(guān)基因的表達(dá)特征可能為研究腦血管畸形的病理機(jī)制提供新線索 。通過對hBVO的研究，有助于深入理解腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，為開發(fā)針對性的治療方法提供理論基礎(chǔ)。 

4. 其他重要結(jié)論：通過對hBVO進(jìn)行基因擾動實驗，明確了多個轉(zhuǎn)錄因子和受體在血管發(fā)育中的關(guān)鍵作用。例如，ETV2對內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育，MECOM雖在hBVO的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，但并非內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育所必需，而是對造血細(xì)胞和某些壁細(xì)胞亞型的分化具有指導(dǎo)作用 。此外，研究還發(fā)現(xiàn)hBVO移植到免疫缺陷小鼠后，內(nèi)皮細(xì)胞可進(jìn)一步成熟并獲得動脈或靜脈樣表型，且壁細(xì)胞在體內(nèi)可分化為多種間充質(zhì)起源的細(xì)胞，這為研究血管發(fā)育后期階段以及細(xì)胞治療提供了重要信息 。 

(四) 創(chuàng) 新 展 望

 4.1 血管類器官的動態(tài)培養(yǎng)與成熟

1. - 提升類器官成熟度：Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng) 能夠模擬體內(nèi)微環(huán)境的動態(tài)條件，如血流、氧氣梯度和營養(yǎng)物質(zhì)的實時交換，這有望促進(jìn)hBVO在體外的進(jìn)一步成熟。通常hBVO在體外培養(yǎng)時未能wan quan獲得明確的動脈-靜脈內(nèi)皮身份，而動態(tài)培養(yǎng)條件可能有助于改善這一局限，使類器官在體外就能更接近體內(nèi)血管的分化和成熟狀態(tài)。

   
   

2. - 增強(qiáng)細(xì)胞功能與相互作用：動態(tài)系統(tǒng)可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞之間的相互作用，模擬體內(nèi)血管的生理功能，如血管收縮和舒張。這種動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境可能使hBVO中的細(xì)胞展現(xiàn)出更接近體內(nèi)的功能特性，例如內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能、壁細(xì)胞對血管穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用等，從而為研究血管功能和疾病機(jī)制提供更準(zhǔn)確的模型。

4.2 多器官芯片系統(tǒng)中的血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1. - 構(gòu)建復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)：Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)允許將多個類器官或不同的組織類型整合在一起，模擬人體不同器官之間的連接和相互作用。結(jié)合hBVO，可以構(gòu)建包含多個血管分支的復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)，模擬人體內(nèi)不同器官的血液供應(yīng)和循環(huán)系統(tǒng)，這對于研究器官間的物質(zhì)交換、藥物分布以及疾病傳播等具有重要意義。

   
   

2. - 研究器官間的相互影響：通過將hBVO與其他器官類器官（如肝臟、腎臟、心臟等）在Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)中進(jìn)行共培養(yǎng)，可以研究血管系統(tǒng)與其他器官之間的相互影響。例如，觀察血管類器官在不同器官微環(huán)境中的適應(yīng)性變化，以及器官病變對血管系統(tǒng)的影響，從而深入了解多器官疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和全身性的病理生理變化。

   
   

   4.3 疾病建模與藥物篩選
   

3. - 更精準(zhǔn)的疾病模型：將攜帶特定血管疾病基因突變的hBVO置于Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)的動態(tài)環(huán)境中，可以更好地模擬疾病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜過程。這種動態(tài)疾病模型能夠更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)疾病的病理生理特征，為研究疾病的分子機(jī)制提供更可靠的平臺，有助于發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物和治療靶點。

   
   

4. - 高通量藥物篩選：Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)的微流控設(shè)計和模塊化結(jié)構(gòu)使其具備高通量篩選的潛力。結(jié)合hBVO，可以在該系統(tǒng)中快速測試大量藥物對血管類器官的影響，評估藥物的療效和安全性。同時，動態(tài)培養(yǎng)條件能夠?qū)崟r監(jiān)測藥物對血管功能的動態(tài)影響，為藥物研發(fā)提供更全面的評估信息，加速血管相關(guān)疾病的藥物發(fā)現(xiàn)進(jìn)程。

公司主營產(chǎn)品：

Kilby 3D-clinostat 三維旋轉(zhuǎn)儀，

Kilby 微/超重力細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，

3D回轉(zhuǎn)重力環(huán)境模擬系統(tǒng)，隨機(jī)定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

Kirkstall 類器官串聯(lián)芯片灌流仿生構(gòu)建系統(tǒng)