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公司關(guān)于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)之成纖維細(xì)胞的消除的書(shū)面分析
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相同，zui特殊的在于成纖維細(xì)胞的排除，成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合生長(zhǎng)，無(wú)法純化腫瘤組織。那么腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性是什么呢？有哪些方法可以成功消除成纖維細(xì)胞呢？
腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是zui多的。另外腫瘤對(duì)人類(lèi)是威脅zui大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。
一、組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性
腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長(zhǎng)增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長(zhǎng)在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其差異較小，但也并非*相同。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點(diǎn)：
（-）形態(tài)和性狀
培養(yǎng)中癌細(xì)胞無(wú)光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動(dòng)和錨著不依賴(lài)性有關(guān)。
（二）生長(zhǎng)增殖
腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的因子，而癌細(xì)胞在低血清中（2%～5%）仍能生長(zhǎng)。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的現(xiàn)象，已成為檢測(cè)細(xì)胞惡變的一個(gè)指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克隆）的能力比正常細(xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時(shí)，接觸抑制消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。
（三）永生性
永生性也稱(chēng)不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無(wú)限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否如此尚無(wú)直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細(xì)胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時(shí)同樣如此?也尚難肯定。從近年建立細(xì)胞系或株的過(guò)程說(shuō)明，如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的，腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實(shí)上，多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時(shí)并不那么容易。生長(zhǎng)增殖并不旺盛;經(jīng)過(guò)純化成單一化瘤細(xì)胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類(lèi)似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期。過(guò)此階段后才獲得永生性，順利傳代生長(zhǎng)下去。從而說(shuō)明體外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無(wú)惡性性的細(xì)胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等細(xì)胞證明，永生性和惡性（包括浸潤(rùn)性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控，但卻有相關(guān)性?？赡苡郎允羌?xì)胞惡變的階段。至少在體外是如此。
（四）浸潤(rùn)性
浸潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能浸潤(rùn)入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長(zhǎng)的能力。
（五）異質(zhì)性
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織;處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱(chēng)干細(xì)胞（Stem Cells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)易于生長(zhǎng)增殖;把干細(xì)胞分離出來(lái)的培養(yǎng)方法稱(chēng)干細(xì)胞培養(yǎng)。
（六）細(xì)胞遺傳
大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個(gè)細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。
（七）其它
腫瘤細(xì)胞在體外不易生長(zhǎng)的原因可能由于：①依賴(lài)性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長(zhǎng)力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴(lài)。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會(huì)同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的活性;②腫瘤細(xì)胞的自泌也會(huì)因分散培養(yǎng)而被稀釋?zhuān)_(dá)不到腫瘤生長(zhǎng)的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖力;③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長(zhǎng)活力和長(zhǎng)的Life Span，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長(zhǎng)能力，但這些細(xì)胞數(shù)量很少;④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。
二、培養(yǎng)方法
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無(wú)原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。（一）要點(diǎn)
1.取材：
人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃中，但不宜栽過(guò)24小時(shí)。
2.培養(yǎng)基：
腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大，是因腫瘤細(xì)胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長(zhǎng)物質(zhì)之故。但這并不說(shuō)明腫瘤細(xì)胞*不需要這些成分。按不同細(xì)胞需要不同的生長(zhǎng)因子;腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對(duì)生長(zhǎng)因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長(zhǎng)因子。有的還需特異性生長(zhǎng)因子〔如乳腺癌細(xì)胞等）?？傊囵B(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)更易成功。
3.成纖維細(xì)胞的排除：
成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快，zui終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細(xì)胞有多種方法（表2-1）。
表2-1 抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因素
| 方法 | 因素 | 組織細(xì)胞 |
| 選擇性附著選擇性附著底物 匯合飼細(xì)胞層 選擇性培養(yǎng)基 | 胰蛋白酶 膠原酶 聚丙烯酰胺 聚四氟乙烯（Teflon） 膠原（豬皮） 小鼠3T3 人胎小腸 D-纈氨酸（Valine） MCDB-710 MCDB-153 Phenobarbitone | 胚胎小腸、心肌、表皮 乳癌 各種腫瘤 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 表皮細(xì)胞 表皮 正常和惡性乳腺上皮 結(jié)腸癌 腎組織 乳腺 表皮 肝細(xì)胞 |
注：上表結(jié)果為個(gè)別實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，僅供參考。
（二）成纖維細(xì)胞排除法
1.機(jī)械刮除法：
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序?yàn)椋?/span>
（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位;
（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間;
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞;
（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至*除掉為止
2.反復(fù)貼壁法：
根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類(lèi)細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液;
（2）取編號(hào)為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶;首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后;向A瓶中補(bǔ)充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng);
（3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中;再向B瓶中補(bǔ)加*培養(yǎng)基。
當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶?jī)深?lèi)細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。
3.消化排除法：
此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化;
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng);向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。
4.膠原酶消化法：
本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化;
（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。
5.其它方法：
有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細(xì)胞，在比重1.050～1.085層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養(yǎng)。zui近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。
選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件，才能獲得好的效果。
（三）提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率措施
根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況：*無(wú)細(xì)胞游出或移動(dòng);有細(xì)胞移動(dòng)和游出，但無(wú)細(xì)胞增殖，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代;有細(xì)胞增殖，傳若干代后停止生長(zhǎng)或衰退死亡;傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢，經(jīng)過(guò)一段停滯期后，才又呈旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長(zhǎng)的腫瘤傳代細(xì)胞系。
以上現(xiàn)象說(shuō)明腫瘤細(xì)胞對(duì)體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過(guò)對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)才能生長(zhǎng)，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采用一些特殊的措施。
1.適宜底物：
把經(jīng)過(guò)純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。
2.生長(zhǎng)因子：
應(yīng)用促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)不同選用不同的促生長(zhǎng)物，常用有胰島素、雌激素以及其它生長(zhǎng)因子。
為提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞（干細(xì)胞）的數(shù)量，可采用動(dòng)物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再?gòu)膭?dòng)物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動(dòng)物以裸鼠。
3.動(dòng)物體媒介培養(yǎng)方法：
（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動(dòng)物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊;
（2）飼養(yǎng)觀察，待腫瘤生長(zhǎng)達(dá)較大體積后，剝?nèi)〕隽鼋M織;
（3）進(jìn)行體外培養(yǎng)。
（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代。通過(guò)裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞培養(yǎng)易于成功。
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細(xì)胞*相同，但成功率比正常細(xì)胞高。
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