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Folin—酚法蛋白質(zhì)含量測定法是zui為靈敏的方法，但其試劑也不容易配制。本實驗的主要目的是掌握分光光度計的使用方法，學(xué)習(xí)Folin—酚法測定血清蛋白的含量。
一、目的
1、學(xué)習(xí)分光光度計的原理和使用方法。
2、學(xué)習(xí)Folin—酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。
3、進一步掌握比色法或分光光度法，準確測定未知樣品。
二、原理
蛋白質(zhì)濃度從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率，比重，紫外吸收測定而得知，或用化學(xué)方法，如定氮，雙縮脲反應(yīng)，Folin—酚法是一般實驗室中經(jīng)常使用的方法。Folin—酚法是雙縮脲法的發(fā)展，反應(yīng)的*步涉及到在堿性溶液中銅一蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，然后這個復(fù)合物去還磷鉬酸—磷鎢酸試劑（Folin氏劑），產(chǎn)生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）。Folin—酚法靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。
所測蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用，濃度較低的尿素（約0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三綠乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙迷（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色反應(yīng)影響，這些物質(zhì)濃度高時必須做校正曲線。含硫酸銨的溶液只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后色淺。則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1—2倍。
三、材料、試劑與器具
（一）材料
血清：使用前稀釋100%
（二）試劑
1、標準酪蛋白溶液：稱取125毫克酪蛋白芬末，用0.1N氫氧化鈉溶液溶解，加蒸餾水到250 毫升，則配成500微克/毫升的標準酪蛋白溶液。
2、Folin—酚試劑甲：由下述四種溶液配制而成。
（1）4%碳酸鈉溶液
（2）0.2N氫氧化鈉溶液
（3）1%硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶液
（4）2%酒石酸鉀鈉溶液，在使用前，將（1）和（2）等體積混合成碳酸鈉—氫氧化鈉溶液。將（3）與（4）等體積混合配成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩種溶液按50：1的比例混合，即為Folin—酚試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。
3.Folin—酚試劑乙：在2升的磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100克，鉬酸鈉（Na2MOO4·2H2O）25克，蒸餾水700毫升，85%磷酸50毫升和濃鹽酸100毫升，充分沸合后以小火回流10小時，再加入硫酸鋰（Li2SO4）150克，蒸餾水50毫升及數(shù)滴液體溴。然后開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以驅(qū)除過量的溴。冷卻后定容到1000毫升，過濾，溶液呈綠色。
用Folin—酚試劑乙滴定標準氫氧化鈉溶液（1N左右）以標定Folin—酚試劑乙的濃度。以酚酞為指示劑。當溶液的顏色由紅色變?yōu)樽霞t色、紫灰，再突然轉(zhuǎn)變?yōu)槟G時，即為終點。該試劑酸度一般為2N左右，此為貯存液。也可以用氫氧化鈉去滴定Folin—酚試劑乙，但終點較不易掌握，此時溶液顏色由淺黃變?yōu)闇\綠，再變?yōu)榛易蠟榻K點。
使用前應(yīng)予以適當稀釋，使其成為1N的酸，此為Folin—酚試劑乙使用液。
以上兩液均應(yīng)裝于棕色瓶內(nèi)，貯于冰箱中，可以長期保存。
（三）器具
1、試管及試管架
2、吸量管（1，5毫升）
3、可見光分光光度計
四、操作步驟
（一）標準曲線的制作
取12支試管，分別加入0, 0.2 , 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升標準酪蛋白溶液（500微克/毫升）用水補足到1.0毫升，以上每種濃度各做一份重復(fù)，即平行做兩份，按順序向各管加入3毫升Folin—酚試劑甲，混勻，室溫下放置10分鐘，再依次向各管加入0.3毫升Folin—酚試劑乙，立即搖勻，在30℃保溫（或室溫下放置）30分鐘，然后于500nm處比色?？磧蓚€平行管的光密度值是否接近，取其平均值，以光密度（0.D）為縱坐標，以酪蛋白溶液濃度為橫坐標，繪制酪蛋白的標準曲線。
（二）血清樣品的測定
取2支試管，各加入一定量血清稀釋液（應(yīng)使其蛋白質(zhì)含量在酪蛋白標準曲線范圍之內(nèi)）本實驗取0.4毫升血清稀釋液，再加0.6毫升蒸餾水使樣品體積達到1毫升。其他操作與“標準曲線的制作”相同。
（三）計算
將血清樣品的光密度讀數(shù)在標準曲線上查出相應(yīng)標準酪蛋白溶液的濃度，再折算成每毫升血清稀釋液含蛋白質(zhì)的微克數(shù)。然后乘以稀釋倍數(shù)，得出每毫升未稀釋血清蛋白質(zhì)的微克數(shù)，zui后打算成臨床化驗上通用的單位克%，即100毫升血清中含蛋白質(zhì)的克數(shù)。
五、注意事項
1、Folin—酚法所用的試劑是由兩部分組成，試劑甲相當于雙縮脲試劑，可與蛋白質(zhì)中的肽鍵起顯色反應(yīng)，試劑乙（磷鉬酸和磷鎢酸混合液）在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被銅—蛋白質(zhì)復(fù)合物還原成鉬藍和鎢藍。因此，在進行測定時加Folin—酚試劑要特別小心，因為Folin—酚試劑乙僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上還原反應(yīng)只是在pH10的條件下發(fā)生，故當Folin—酚試劑乙加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻。以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，（還原反應(yīng)即能發(fā)生）能有效地被Cu2+—蛋白質(zhì)結(jié)合物所還原。
2、此法也適用于酪氨酸和色氨的定量測定。
六、實驗報告
繪制標準曲線，將實驗所獲結(jié)果與其他蛋白定量測定方法比較，說明其優(yōu)缺點。
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