Matrigel 使用指南及常見疑問

Matrigel 收貨注意事項，請檢查：

1.       盒子內(nèi)是否有干冰

2.       基質(zhì)膠是否呈固態(tài)，膠面是否水平

3.       基質(zhì)膠顏色是否在正常范圍（黃色-粉紅-深紅）

產(chǎn)品特性 ：

Martrigel基質(zhì)會有色差變化（淡黃色到深紅色），是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2的作用引起的，但是與5%CO2平衡后色差即會減少。

基質(zhì)膠凍融操作 ：

收貨后，若不立刻使用基質(zhì)膠，應(yīng)馬上將仍然是冷凍固態(tài)的基質(zhì)膠放進-20℃冰箱保存。使用前須先將基質(zhì)膠凍融。

凍融：

將基質(zhì)膠埋于鋪滿碎冰的冰盒中，然后將整冰盒放入4℃冰箱stay overnight溶解。（普通濃度的基質(zhì)膠，溶解時間1-2天；高濃度基質(zhì)膠溶解時間 3-7天）。

分裝：

溶解后的須分裝保存，以避免反復(fù)凍融。液態(tài)基質(zhì)膠，會在10℃以上快速成膠（特別是高濃度基質(zhì)膠），因此，分裝時，接觸到基質(zhì)膠的耗材必須預(yù)冷（如移液管、吸頭、EP管等），并且整個實驗必須無菌、冰上操作。（高濃度的基質(zhì)膠比較粘稠，用移液器不好吸取，可以使用去掉針頭的預(yù)冷注射器吸取。）

保存：

分裝后的基質(zhì)膠在冰上應(yīng)仍然呈現(xiàn)液態(tài)，此時將基質(zhì)膠放進-20℃保存即可。進行實驗時，取出分裝好的小管，4℃凍融。若分裝好后基質(zhì)膠已經(jīng)凝固，說明分裝操作不能很好地保持低溫，導(dǎo)致基質(zhì)膠已經(jīng)成膠，不適宜使用。

普通濃度基質(zhì)膠操作：

包被與成膠

細胞可在0.5mm厚度的基質(zhì)膠表面生長，可以在1mm厚度的三維基質(zhì)內(nèi)生長。過度稀釋的基質(zhì)膠會形成非膠質(zhì)的蛋白層，可以用于細胞貼壁，但不能用于細胞的研究分化。為保證基質(zhì)膠的成膠性能與穩(wěn)定，稀釋濃度不應(yīng)低于1：3，可用預(yù)冷無血清培養(yǎng)基稀釋，成膠后立即使用。

薄膠成膠方法：

1．凍融后，用預(yù)冷的移液槍頭混勻基質(zhì)膠成勻漿狀。

2．  將需要使用的培養(yǎng)板置于冰上，加入濃度為50ul/cm2生長面積的基質(zhì)膠。

3．  在37℃放置30min，即可使用。

厚膠成膠方法

1.      凍融后，用預(yù)冷的移液槍頭混勻基質(zhì)膠成勻漿狀。

2.      將需要使用的培養(yǎng)板置于冰上，將培養(yǎng)的細胞與基質(zhì)膠混合，用移液槍頭使其懸浮于基質(zhì)中。加入濃度為150-200 ul/cm2生長面積的基質(zhì)膠。

在37℃放置30min，可成膠。也可以加入細胞培養(yǎng)的基質(zhì)，也可使細胞直接生長在膠表面。

薄層包被方法：

1.     凍融后，用預(yù)冷的移液槍頭混勻基質(zhì)膠成勻漿狀。

2.     根據(jù)需要，采用無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠，根據(jù)實驗需要確定*包被濃度。

3.     將稀釋的基質(zhì)膠包被與所需的培養(yǎng)器皿中，包被量至少覆蓋整個器皿的生長表面，室溫下孵育1小時。

去除未結(jié)合的基質(zhì)膠，用無血清培養(yǎng)基輕輕地沖洗。備注：普通濃度的基質(zhì)膠，建議稀釋濃度不低于3mg/ml；我們不能保證稀釋濃度低于3mg/ml能夠成膠。

普通濃度的基質(zhì)膠，不建議用于成瘤實驗。

BD細胞回收劑354253，離散酶354235，冰浴7小時后回收得到細胞。

腫瘤侵襲實驗：

操作過程

1.     凍融（對于預(yù)包被的24孔培養(yǎng)小室請參考1.1-1.3操作，對于自己包被好待用的24孔小室，請直接從步驟2開始）

1.1  從-20℃冰箱中取出產(chǎn)品，使其自然升溫到室溫。

1.2  取出培養(yǎng)板在細胞小室內(nèi)加入500μL 37℃預(yù)熱的PBS，37℃無CO2環(huán)境下孵育2小時。

1.3  解凍后，小心去除小室內(nèi)的培養(yǎng)基，避免破壞Matrigel基質(zhì)膜。

2.     染色劑后標記法

細胞通過侵襲消化基質(zhì)膜后遷移到下小室，采用熒光標記定量細胞。細胞的侵襲能力用終點計算法計算得到。對于采用實時動力曲線的計算，推薦使用前標記法。

2.1 如步驟1 準備培養(yǎng)板。

2.2 胰酶消化細胞單層后制得細胞懸液，溶于無血清DMEM培養(yǎng)基，推薦濃度為5×10⁴cells/mL。

2.3 上小室中加入500μL細胞懸液（2×10⁴ cells）。

2.4 通過進樣口在下小室中加入750μL誘導(dǎo)劑。

2.5 在37℃，5% CO2 條件下孵育培養(yǎng)板和對照板20-22小時（由細胞類型決定）。

2.6 孵育后，小心去除上小室中的培養(yǎng)基及基質(zhì)膠，避免破壞小室的膜及膜底侵襲轉(zhuǎn)移的細胞。

2.7 將培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)移到另一塊24孔板中，結(jié)晶紫或鈣黃綠素染色。計算。