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            分光光度計(jì)的原理和分類

            來源:上海添時(shí)科學(xué)儀器有限公司   2014年09月23日 14:06  

            一.分光光度計(jì)的一般原理:

            分光光度計(jì)是利用分光光度法,通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度,對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

            不同種類的分光光度計(jì)的基本原理相似,都是利用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源。光源透過測(cè)試的樣品后,部分光源被吸收,通過測(cè)量樣品的吸光值,經(jīng)過計(jì)算可以轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

            二.分光光度計(jì)有哪些不同的類型,不同種類的應(yīng)用領(lǐng)域的區(qū)別:

            分光光度計(jì)有哪幾種不同的分類方式:

            1.分光光度計(jì)按照波長及應(yīng)用領(lǐng)域的不同可以分為:

            (1)可見光分光光度計(jì):測(cè)定波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū);

            (2)紫外分光光度計(jì):測(cè)定波長范圍為200~400nm的紫外光區(qū);

            (3)紅外分光光度計(jì):測(cè)定波長范圍為大于760nm的紅外光區(qū);

            (4)熒光分光光度計(jì):用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜;

            (5)原子吸收分光光度計(jì):光源發(fā)出被測(cè)的特征光譜輻射,被經(jīng)過原子化器后的樣品蒸氣中的待測(cè)元素基態(tài)原子所吸收,通過測(cè)定特征輻射被吸收的大小,來求出被測(cè)元素的含量。

            2.分光光度計(jì)按自動(dòng)化程度分類:可分為手動(dòng)、半自動(dòng)、自動(dòng)分光光度計(jì)。

            3.分光光度計(jì)按軟件可分為:帶掃描、不帶掃描。

            三.分光光度計(jì)常見的用途:

            1.核酸的定量

            核酸的高吸收峰的吸收波長260 nm。利用260nm的波長可以定量測(cè)量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA的濃度。

            除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度。如A260/A280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。

            A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。

            A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。

            2.蛋白質(zhì)的直接定量

            這種方法是在280nm波長,直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。

            3.細(xì)菌細(xì)胞密度

            細(xì)菌培養(yǎng)過程中,需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。

            OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。在600nm波長下,以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,測(cè)量定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。

            四.幾種常見的分光光度計(jì)的用途的區(qū)別:

            (1)可見分光光度計(jì)

            用來測(cè)量待測(cè)物質(zhì)對(duì)可見光(400~760nm)的吸光度并進(jìn)行定量分析的儀器,稱為可見分光光度計(jì)??稍?00nm測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。

            (2)紫外可見分光光度計(jì)

            紫外可見光譜儀用來測(cè)量待測(cè)物質(zhì)對(duì)可見光或紫外光(200~760nm)的吸光度并進(jìn)行定量分析的儀器。可以測(cè)定核酸和蛋白的濃度,也可以測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。

            紫外分光光度計(jì)又可分為單光束,假雙光束,雙光束。它們的用途又有區(qū)別。

            單光束:適于在給定波長處測(cè)量吸光度或透光度,一般不能作全波段光譜掃描,要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。

            雙光束:自動(dòng)記錄,快速全波段掃描??上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響,特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜,價(jià)格較高。

            假雙光束也就是比例雙光束,它的原理是由同一單色器發(fā)出的光被分成兩束,一束直接到達(dá)檢測(cè)器,另一束通過樣品后到達(dá)另一個(gè)檢測(cè)器。這種儀器的優(yōu)點(diǎn)是可以監(jiān)測(cè)光源變化帶來的誤差,但是并不能消除參比造成的影響。

            (3)紅外分光光度計(jì)

            一般的紅外光譜是指大于760nm的紅外光譜,這是研究有機(jī)化合物常用的光譜區(qū)域,能分析各種狀態(tài)(氣、液、固)的試樣。

            紅外光譜法的特點(diǎn)是:快速、樣品量少(幾微克-幾毫克),特征性強(qiáng)(各種物質(zhì)有其特定的紅外光譜圖)、能分析各種狀態(tài)(氣、液、固)的試樣以及不破壞樣品。

            (4)熒光分光光度計(jì)

            熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。應(yīng)用于科研、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保以及臨床檢驗(yàn)、食品檢驗(yàn)、教學(xué)實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域。

            通過對(duì)這些參數(shù)的測(cè)定, 不但可以做一般的定量分析,而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化,從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。

            (5)原子吸收分光光度計(jì)

            該法主要適用樣品中微量及痕量組分分析常規(guī)儀器之一。是材料分析及質(zhì)量控制部門進(jìn)行常量、微量金屬(半金屬)元素分析的有力工具。

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