聲明：尊敬的客戶，感謝您選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測血清、血漿或其
它相關(guān)生物液體中天然和重組 VD 濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分！

試劑盒組成： 
中文名稱 英文名稱 規(guī)格 保存條件 
ELISA 酶標板（可拆卸） Micro ELISA Plate(Dismountable) 8×12 / 8×6 * 4℃/-20℃ # 
凍干標準品 Reference Standard 2/1 支* 4℃/-20℃ # 
標準品&樣品稀釋液 Reference Standard & Sample Diluent 1 瓶 20mL/12mL * 4℃ 
濃縮生物素化抗體 Concentrated Biotinylated Detection Ab 1 支 120μL/70μL * 4℃/-20℃ # 
生物素化抗體稀釋液 Biotinylated Detection Ab Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃ 
濃縮 HRP 酶結(jié)合物 Concentrated HRP Conjugate 1 支 120μL/70μL * 4℃(避光) 
酶結(jié)合物稀釋液 HRP Conjugate Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃ 
濃縮洗滌液（25×） Concentrated Wash Buffer (25×) 1 瓶 30mL/16mL * 4℃ 
底物溶液（TMB） Substrate Reagent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃(避光) 
反應(yīng)終止液 Stop Solution 1 瓶 10mL/6mL * 4℃ 
封板覆膜 Plate Sealer 5/3 張* 
產(chǎn)品說明書 Product Description 1 份 
質(zhì)檢報告 Certificate of Analysis 1 份 
特別說明： 
*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整） 
#: 一周內(nèi)使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃. 
相關(guān)試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，請在使用時量取而非直接倒出！ 
 
檢測原理: 
本試劑盒采用競爭ELISA法。用VD抗原包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中的VD與包被的
VD競爭生物素標記的抗VD單抗上的結(jié)合位點，游離的成分被洗去。加入辣根過氧化物酶標記的
親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，
TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測
OD值，VD濃度與OD450值之間呈反比，通過繪制標準曲線計算出樣品中VD的濃度。 
 
 
  
 
 
3 
樣品收集: 
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃隔夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集
血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。 
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可
檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。 
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會
影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體
積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組
織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，
取上清檢測。 
4. 細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。 
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測 
具體處理方法可參考：http://www.elabscience。。ｃｎ/index.php/resources/view/aid/17671.jsp 
6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。 
7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍
存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。 
8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先
做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。 
 
試驗所需自備物品: 
1. 酶標儀(450nm波長濾光片) 
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 
4. 吸水紙 
 
檢測前準備工作: 
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)
晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用 
3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，
靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為400ng/mL）。
然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃
度：400、200、100、50、25、12.5、6.25、0ng/mL，標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔
0ng/mL。如配制200ng/mL標準品：取0.5mL400ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&
樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 
4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以50μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配 
 
 
4 
制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作
濃度。當(dāng)日使用。 
5. 酶結(jié)合物工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制
100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。
當(dāng)日使用。 
標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200μL/管） 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 
 400 200 100 50 25 12.5 6.25 0 ng/mL 
 
洗滌方法: 
1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。 
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸
去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。 
 
操作步驟: 
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。 
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液 50μL，余孔分
別加標準品或待測樣品 50μL，立即每孔加入配好的生物素化抗體工作液 50μL（在使用前
15 分鐘內(nèi)配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕
晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 45 分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新
的標準品溶液。 
2. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL /每孔，甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。 
3. 每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前 15 分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。 
4. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。 
5. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實際顯色情
況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當(dāng)標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止）。 
6. 每孔加終止液 50μL，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的 
 
5 
加入順序相同。 
7. 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應(yīng)提前打開酶標儀電源，預(yù)熱儀
器，設(shè)置好檢測程序。 
8. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結(jié)束。 
 
注意事項： 
1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。 
2. 酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成
任何影響。暫時不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！ 
3. 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的
“預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。每次的加樣時間控制在
10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。 
4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，避免酶標
板處于干燥狀態(tài)；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。 
5. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸
水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數(shù)。 
6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小，
運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用*0轉(zhuǎn)/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的
液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗體工
作液、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請
配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時，
一次不要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標
準品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標準品應(yīng)按照每一次用量分
裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。 
7. 顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很
明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免顏色過深影響酶標儀讀數(shù)。 
8. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。 
9. 混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量
振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。 
10. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品
時，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。 
11. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外） 
12. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結(jié)果！ 

結(jié)果判斷: 
1. 以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。如有設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均
值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標，
標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。 
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，
由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程
式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 
3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。 
 
靈敏度、檢測范圍、特異性和重復(fù)性: 
●靈敏度：zui小可測 3.75ng/mL。 
●檢測范圍：6.25–400ng/mL。 
● 特異性：可檢測重組或天然的 VD，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。 
● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。 
 
操作概要 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. 在各孔中加入標準品或樣品各 50μL 
2. 立即加入 50μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育 45 分鐘 
3. 洗滌 3 次 
4. 加入 100μL 酶結(jié)合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘 
5. 洗滌 5 次 
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右 
7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長處測量 OD 值 
8. 結(jié)果計算

問題分析 
若實驗效果不好，請及時對顯色結(jié)果拍照，保留所用板條及未使用試劑，并妥善保存，然后聯(lián)
系我公司為您解決問題。同時您也可以參考以下資料： 
問題描述 可能原因 相應(yīng)對策 
標準曲線梯
度差 
吸液或加液不準 檢查移液器及吸頭 
標準品稀釋不正確 溶解標準品時稍微旋轉(zhuǎn)瓶身，輕輕混勻使粉末*溶解 
洗滌不* 保證洗滌時間和洗滌次數(shù)及每孔的加液量 
顯色很弱或
無色 
孵育時間太短 保證充足的孵育時間 
實驗溫度不正確 使用推薦的實驗溫度 
試劑體積不夠或漏加 
檢查吸液及加液過程，保證所有試劑按順序足量添加 
稀釋不正確 
讀數(shù)數(shù)值低 酶標儀設(shè)置不正確 
在酶標儀上檢查波長及濾光片設(shè)置 
提前打開酶標儀預(yù)熱 
變異系數(shù)大 加液不正確 檢查加液情況 
背景值高 
檢測抗體的工作濃度
過高 
使用推薦的稀釋倍數(shù) 
酶標板洗滌不* 
重新閱讀操作手冊，保證清洗*；如果用自動洗板機，
請檢查所有的出口是否有堵塞 
洗液有污染 配制新鮮的洗液 
靈敏度低 
ELISA 試劑盒保存
不當(dāng) 
按說明書要求保存相關(guān)試劑 
讀數(shù)前未終止 OD 讀數(shù)前應(yīng)在每孔中加入終止液 
 
聲明 
1. 限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平，尚不能對所有原料進行全面的鑒定分析，本產(chǎn)品可能存在
一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。 
2. zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)
必準備充足的待測樣品。 
3. 只有全部使用試劑盒內(nèi)的試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格
遵守 Elabscience 的實驗說明才會得到*的檢測結(jié)果。 
4. 有效期：6 個月。 
5. 本操作說明同樣適用于 48T 試劑盒。