關(guān)鍵詞:內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶(hù)不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶(hù)可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
1.干粉培養(yǎng)基原倍液的配制
1）配制過(guò)濾除菌的細(xì)胞培養(yǎng)基
①閱讀培養(yǎng)基使用說(shuō)明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。
②根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下整理并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。
③加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。
④輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。
⑤用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
⑥用0.22μm濾膜正壓過(guò)濾除菌。
⑦溶液應(yīng)在2℃～8℃下避光保存。
2.配制可高壓滅菌細(xì)胞培養(yǎng)基
①根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。
②在121℃、15psi下滅菌15分鐘。
③待溶液冷卻至室溫，加入無(wú)菌0.2mol/LL-谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無(wú)菌7.5%（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。
④如果必要，用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
⑤溶液應(yīng)在2℃～8℃下避光保存。
內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞，對(duì)于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長(zhǎng)因子（TAF）等有很大價(jià)值。
研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法zui為簡(jiǎn)便，其法如下：
1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無(wú)菌剪取10—15厘米長(zhǎng)一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時(shí)內(nèi)保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線(xiàn)繩扎緊，以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿(mǎn)血管，消化3—10分鐘；注入口用線(xiàn)繩扎，以防液體返流。
4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。
5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)成單層。
腫瘤條件培養(yǎng)基制備：
1．取C3H小鼠的S-180實(shí)體肉瘤組織。
2．胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)液15ml（含10％小牛血清），接種到T-75 Falcon產(chǎn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3．在細(xì)胞生長(zhǎng)接近*匯合時(shí)，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲得多量條件培養(yǎng)基。
4．4000轉(zhuǎn)/分離心后，再通過(guò)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，－20℃凍存?zhèn)溆茫ㄅR用前融解）。
初代培養(yǎng)：
1．取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個(gè)，先用Hanks液洗除血污。
2．剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成1立方毫米小塊，加0.5％膠原酶室溫中消化1小時(shí)，每隔10分鐘用吸管吹打懸液令消化充分。
3．通過(guò)不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)，網(wǎng)眼要求只允許能通過(guò)小于110微米長(zhǎng)的毛細(xì)血管小段。
4．650rpm，4℃，離心7分鐘后，棄掉上清膠原酶。
5．沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次。
6．末次沉淀物仍用含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打。
7．接種于鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)頭1～3小時(shí)中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞zui先帖附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在培養(yǎng)液中漂浮。
8．趁此時(shí)，吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液，每?jī)商鞊Q液一次。毛細(xì)血管小段一般成自1～4個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，以后每個(gè)小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)2～5天。
毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：
1．初代培養(yǎng)2～3天后，鏡下確認(rèn)幾個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起。
2．鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除。此操作用細(xì)胞解剖器或用手操作均可，宜在凈化臺(tái)無(wú)菌氣流中、打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（15～20分鐘），圈內(nèi)非內(nèi)皮細(xì)胞可用無(wú)菌膠刮除。
3．用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞。
4．剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小（5～20個(gè)細(xì)胞）而少時(shí)，生長(zhǎng)增值變得緩慢或不*不生長(zhǎng)，此時(shí)需加入3T3等飼細(xì)胞，飼細(xì)胞接種量為4000細(xì)胞/cm2。
5．當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿(mǎn)所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基。
6．接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)（飼細(xì)胞死亡淘汰），細(xì)胞增殖生長(zhǎng)匯合后，按1：5傳代。