關(guān)鍵詞:侵襲小室實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
侵襲小室小室制備
① 包被基底膜：
用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。如果需要在下室面鋪FN的話(huà)，可將200ul槍頭的剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話(huà)，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。
有基質(zhì)膠的Transwell小室制備
Chemicon公司的ECM550系列說(shuō)明書(shū)要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300μl預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15－30min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。
制備細(xì)胞懸液
① 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
② 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1－10×105。
具體實(shí)驗(yàn)時(shí)采用密度要自己摸索，因?yàn)椴煌?xì)胞，其侵襲能力是不同的。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞量過(guò)多，穿過(guò)膜的細(xì)胞會(huì)過(guò)多過(guò)快，如果zui后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話(huà)將難以計(jì)數(shù)；而過(guò)少的話(huà)，可能還沒(méi)到檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過(guò)，因此zui少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。
個(gè)人認(rèn)為，對(duì)照組和處理盡量不要分開(kāi)計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果需要對(duì)細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開(kāi)計(jì)數(shù)，那么計(jì)數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準(zhǔn)確，盡量保證對(duì)照組和處理組細(xì)胞密度一致。
接種細(xì)胞
① 取細(xì)胞懸液100－200μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對(duì)細(xì)胞懸液量有不同要求，請(qǐng)參考說(shuō)明書(shū)。24孔板小室一般200μl。
② 24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請(qǐng)參考說(shuō)明書(shū)。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。
③ 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。
通過(guò)給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞
① 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞
② 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺(tái)肦藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。
依據(jù)膜孔徑選擇適合您實(shí)驗(yàn)用途的*膜:
0.4um型：掃描電鏡；光鏡下活細(xì)胞的觀察；免疫化學(xué)染色
0.4um高密度（孔多）型：小分子的運(yùn)輸，擴(kuò)散和分泌；TEER檢測(cè)；藥物生物活性檢測(cè)
1.0um型：光鏡下活細(xì)胞的觀察，分子的運(yùn)輸，擴(kuò)散和分泌；免疫化學(xué)染色；藥物生物活性檢測(cè)
3.0um型：光鏡下觀察；掃描電鏡；大分子和病毒的運(yùn)輸；細(xì)胞遷移
3.0um高密度型：大分子和病毒的運(yùn)輸，分泌和擴(kuò)散；細(xì)胞遷移
8.0um型：腫瘤侵襲；細(xì)胞遷移；趨化研究；腫瘤轉(zhuǎn)移