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實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealTime PCR)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
1 收集樣品
2 相關(guān)試劑 總RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV(cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶), RNA 純化試劑, RealqPCR MasterMix (熒光定量PCR預(yù)混試劑)。
3 實(shí)驗(yàn)儀器 熒光定量PCR儀; PCR儀;低溫離心機(jī)。
4 總RNA提取
5 cDNA合成 在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl); 2µl隨機(jī)引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl體系。混勻后70℃變性RNA 5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl體系。PCR儀中反應(yīng)條件設(shè)置 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應(yīng)。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?br>6 引物設(shè)計(jì)與thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7 實(shí)時(shí)定量PCR 按以下反應(yīng)體系進(jìn)行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR儀擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個(gè)循環(huán))。
8 PCR產(chǎn)物溶解曲線分析 將所擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。溶解曲線生成的反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
9 數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用
1. DNA 或RNA 的定量分析:包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi 基因失活率的檢測(cè)等;
2. 基因表達(dá)差異分析:例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證;
3. 基因分型:例如SNP 檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等。