人Ⅱ型膠原抗體試劑盒使用說明書

　　本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關液體樣本中Ⅱ型膠原抗體（Col Ⅱ Ab）的含量。

　　人Ⅱ型膠原抗體試劑盒實驗原理：

　　本試劑盒應用雙抗原夾心法測定標本中人Ⅱ型膠原抗體（Col Ⅱ Ab）水平。用純化的人Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被單抗的微孔中依次加入Ⅱ型膠原抗體（Col Ⅱ Ab），再與HRP標記的Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）抗原結合，形成抗原-抗體-酶標抗原復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人Ⅱ型膠原抗體（Col Ⅱ Ab）濃度。

　　人Ⅱ型膠原抗體試劑盒試劑盒組成：

　　人Ⅱ型膠原抗體試劑盒樣本處理及要求：

　　1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

　　2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

　　3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

　　4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

　　5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

　　6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

　　7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

　　操作步驟

　　1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在*、第二孔中分別加標準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為48μg/L,32μg/L ,16μg/L, 8μg/L, 4μg/L）。

　　2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

　　6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

　　7. 溫育：操作同3。

　　8. 洗滌：操作同5。

　　9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

　　10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

　　11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

　　注意事項：

　　1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

　　2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

　　3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

　　4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

　　5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　6．底物請避光保存。

　　7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

　　8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

　　9．本試劑不同批號組分不得混用。

　　10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

　　計算：

　　以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，

　　在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD

　　值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋

　　倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標

　　準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值

　　代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋

　　倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。