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            ELISA試劑盒的包被條件幾點(diǎn)小結(jié)

            來(lái)源:上海雙贏生物科技有限公司   2015年10月14日 23:49  

            上海雙贏生物科技有限公司定期發(fā)布ELISA試劑盒操作要點(diǎn)及相關(guān)技術(shù)問題,一下是我司技術(shù)老師就ELISA試劑盒的包被條件做出的幾點(diǎn)解釋與小結(jié):

               (一)如何選擇合適的陽(yáng)性對(duì)照?

              陽(yáng)性對(duì)照的基本組成應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致,一般陽(yáng)性對(duì)照多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì),加入一定量的待檢物質(zhì)。比如,以人血清為標(biāo)本的測(cè)定,陽(yáng)性對(duì)照多用確定的病人血清或者以復(fù)鈣人血漿為原料加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品。如何選擇合適的陰性對(duì)照?陰性對(duì)照的基本組成也應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致,先 行檢測(cè)確定其中不含待檢物質(zhì)。比如,檢測(cè)人血清標(biāo)本時(shí),陰性對(duì)照應(yīng)該選擇正常人血清;檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中抗體效價(jià)時(shí),陰性對(duì)照應(yīng)該選擇該動(dòng)物的免疫前血清。

              (二)如何選擇*化的包被條件?

              1.包被抗原的選擇

              包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。 天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被,對(duì)于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被(先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上,再通過(guò)特 異性反應(yīng)使抗原固相化)。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機(jī)化合物,由于分子量太小,往往難于直接吸附在酶標(biāo)板 上,一般都先使其與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián),偶聯(lián)物吸附于固相載體上。

              2.包被液的選擇一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液,如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話,也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。

              3.包被溫度的選擇通常是4-8度條件下過(guò)ye或者37度保溫2小時(shí),我們強(qiáng)烈建議4-8度條件下包被,有利于蛋白活性的保持。

              4. 包被濃度的選擇包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化,一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml,要明確針對(duì)特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。包板后需要封閉嗎?應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系?封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。一般說(shuō)來(lái),雙抗體夾心法,只要酶標(biāo)記物 是高活性的,操作時(shí)洗滌*,不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。而在間接法測(cè)定中,封閉一般是*的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、 10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉,AbMART推薦使用5%脫脂奶粉,價(jià)廉而且封閉能力強(qiáng),不過(guò)5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用,不宜長(zhǎng)期保 存,所以ELISA試劑盒中較少使用。

              (三)如何正確使用酶結(jié)合物?

              1.酶結(jié)合物的稀釋液在稀釋液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)(例如1%BSA或5%脫脂奶粉),通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制酶結(jié)合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,如吐溫20(0.05%的濃度較為適宜)。

              2.正確稀釋酶結(jié)合物酶結(jié)合物的合適工作濃度需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定,濃度過(guò)高易導(dǎo)致本底偏高,濃度過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性信號(hào)的減弱。酶結(jié)合物在使用前稀釋,稀釋后的酶結(jié)合物不宜長(zhǎng)期保存,因?yàn)榈蜐舛鹊拿附Y(jié)合物極易失活。

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