免疫PCR試驗(yàn)方法

（一）材料與方法
1. 生物素標(biāo)記特異性抗體的制備  免疫球蛋白（如IgG、IgM）的Fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結(jié)合的Biotin-hydrazide作生物素標(biāo)記。
（1） 將純化的抗體（IgM或IgG， 0.1~1.0ml）在標(biāo)記緩沖液（0.1Mol/L NaAc，pH值5.5， 0.1Mol/L NaCl）中4℃透析。
（2）吸取0.5ml至微量離心管中，加過碘酸鈉溶液至終濃度為10mMol/L，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。
（3）將氧化的抗體過PBS平衡的Sephadex G25 PD-10預(yù)裝柱，使之與過碘酸鈉分開。收集蛋白峰。
（4）向抗體管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至終濃度5mMol/L，置混搖器上室溫孵育1h。
（5）用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25預(yù)裝柱，將生物素標(biāo)記的抗體分子過柱與游離的生物素分開。收集蛋白峰，保存-20℃。    
2. 生物素標(biāo)記DNA片段的制備  作為將與抗體偶聯(lián)的報(bào)告DNA片段，應(yīng)確保在待測抗原來源的機(jī)體DNA中無同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報(bào)告DNA去檢測人源的標(biāo)本。DNA片段大小為300~500bp，生物素標(biāo)記可采用PCR方法，根據(jù)報(bào)告DNA的核苷酸序列合成一對引物，其中一個(gè)引物的5’端堿基上帶有生物素標(biāo)記。
在0.5mlPCR管中按表將下列試劑混合。
表PCR系統(tǒng)組成

加水至 100uL 
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴(kuò)增：94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1min; 40個(gè)循環(huán)。zui后72℃延伸10min。
加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL無水乙醇，置-70℃30min。
離心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。
將沉淀DNA干燥后溶于TE緩沖液中，保存在-20℃。
3. 制備抗體-親和素-DNA復(fù)合物  將生物素標(biāo)記的抗體與親和素按等分子濃度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室溫孵育30min，再加入兩倍分子濃度的生物素標(biāo)記的DNA片段，繼續(xù)孵育30min，zui后加入10倍分子濃度的生物素，將親和素分子上的結(jié)合部位飽和。zui后過凝膠過濾柱將復(fù)合物與未結(jié)合的單體分開，加入BSA達(dá)1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。
4.  免疫PCR
（1） 按常規(guī)ELISA方法，用飽和緩沖液稀釋抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃。
（2） 用PBS洗三次，然后每孔加200ul封閉液（PBS含10mg/ml BSA，1mg/ml魚精DNA），室溫孵育30min。
（3） 用TETBS（其配方：20mMol/L EDTA，0.02%NaN3）洗三次。
（4） 將抗體-親和素-DNA復(fù)合物稀釋于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml魚精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室溫孵育1h。
（5） 用TETBS洗5次，然后將塑料板或管倒置在吸水紙上拍打以控干水分。
（6） 每管中加50ulPCR反應(yīng)液，含有表成分：

加水至50μL 
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。zui后72℃延伸10min。
每管取5ul作瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察結(jié)果，如在PCR時(shí)加入了放射性核素標(biāo)記，則可用X光片顯影。
亦可在凝膠電泳后做Southern-blot，用特異性探針雜交，進(jìn)一步提高其特異性和敏感性?！?/span>

(二)注意事項(xiàng)
   本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是獲得適當(dāng)?shù)目贵w-DNA復(fù)合物。用鏈親和素將生物素標(biāo)記的抗體與生物素標(biāo)記的DNA偶聯(lián)的方法，因每個(gè)鏈親和素分子可與四個(gè)生物素分子結(jié)合，因此要優(yōu)化反應(yīng)條件，以使得每個(gè)鏈親和素分子既能結(jié)合上抗體分子，又能結(jié)合上DNA片段。
  此外，還可用化學(xué)方法將DNA片段與抗體分子共價(jià)偶聯(lián)，即將抗體分子和5’端氨基酸修飾的DNA片段分別用不同的雙功能偶聯(lián)劑激活，然后通過自發(fā)的反應(yīng)偶聯(lián)到一起，比如，用N-Succinimidyl-S-acetyl thioacetate(SATA)活化氨基修飾的DNA片段，用Sulfo-Succinimidyl4-(maleimidomethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修飾抗體分子，然后將二者在一小管中混合，通過加入鹽酸胲（Hydroxylamine hydrochloride）使二者偶聯(lián)在一起。
免疫PCR具有高敏感性。因此，抗體和標(biāo)記DNA的任何非特異性結(jié)合均可導(dǎo)致嚴(yán)重的本底問題。因而在加入抗體和標(biāo)記DNA后必須盡可能*地清洗。即使有些特異性結(jié)合的抗體或標(biāo)記DNA被洗掉了，亦可在zui后通過增加PCR的循環(huán)次數(shù)得到彌補(bǔ)。此外，應(yīng)用有效的封閉劑對防止非特異性結(jié)合也是非常重要的?？捎妹撝谭酆团Ｑ灏椎鞍鬃龅鞍追忾]劑，用魚精DNA做核酸封閉劑。防止本底信號的另一個(gè)重要因素是控制污染，這也是所有敏感的檢測系統(tǒng)存在的問題。即使每一步試驗(yàn)都做得非常認(rèn)真，重復(fù)使用同樣的引物和標(biāo)記DNA均會產(chǎn)生假陽性信號。  
  免疫PCR的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記DNA序列*是人為選定。因此標(biāo)記DNA及其引物可經(jīng)常變換，以避免由于污染造成的假陽性信號。
免疫PCR可以檢測到常規(guī)免疫學(xué)方法無法檢測的樣品。因此，應(yīng)用免疫PCR可在微觀水平（單細(xì)胞）檢測抗原，定量PCR產(chǎn)物可以估計(jì)某一標(biāo)本中的抗原數(shù)量，在臨床診斷中可在疾病早期抗原量很低時(shí)檢測到微量的抗原。