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由于HRP的底物H2O2本身又是ELISA試劑盒酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時間反應(yīng)后呈色即達高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。
酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成ELISA試劑盒堿而結(jié)合。后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。
2.實驗步驟
HRP的制備
1.水提取：稱取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機中絞碎1～2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(或離心機)甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測得總體積。為了保證ELISA試劑盒實驗的準確性，實驗操作中加入的緩沖液和各組分一定要，將洗滌液加入酶標板中的時候防止加入的試劑混入另外一個酶標孔，嚴防交叉污染。
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