更安全更快速的再生醫(yī)學(xué)策略：利用直接重編程改變細(xì)胞身份

在死亡之前，已變成皮膚細(xì)胞的細(xì)胞仍然是皮膚細(xì)胞。在過去十年，明顯的是，細(xì)胞身份并不是一成不變的，它能夠通過激活特異性的遺傳程序而得以重寫。如今，再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨著一個問題：這種重寫應(yīng)當(dāng)采取常規(guī)方法，即成熟細(xì)胞首先轉(zhuǎn)化回干細(xì)胞，或者如果可行的話，采取一種更加直接的方法？

術(shù)語“終末分化（terminally differentiated）”概述了一種舊的觀念---皮膚細(xì)胞、肌肉細(xì)胞或其他的成熟細(xì)胞不能夠經(jīng)過誘導(dǎo)而獲得一種顯著不同的命運(yùn)。十年前，這種觀念開始搖搖欲墜，這是因?yàn)槟悄耆毡揪┒即髮W(xué)細(xì)胞生物學(xué)家山中伸彌（Shinya Yamanaka）證實(shí)導(dǎo)入幾個基因能夠?qū)⒊赡甑某衫w維細(xì)胞（結(jié)締組織）轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）[1]。類似于胚胎干細(xì)胞，iPS細(xì)胞能夠分化為任何一種類型的細(xì)胞，這一性質(zhì)被稱作為多能性。不同于胚胎干細(xì)胞---它們必需從人胚胎中收集，因此面臨著而巨大的政治負(fù)擔(dān)---的是，iPS細(xì)胞也能夠無*地增殖。 

僅僅在山中伸彌的發(fā)現(xiàn)---這一發(fā)現(xiàn)讓他贏取2012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎---幾年后，研究人員就已開始發(fā)現(xiàn)改變細(xì)胞類型的捷徑，他們稱之為“直接重編程”，即一種類型的成熟細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后能夠直接變成另一種類型的成熟細(xì)胞，而不需要借助產(chǎn)生iPS細(xì)胞這一中間階段。研究人員已了解到如何將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元或心臟細(xì)胞，如何將胃細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分泌胰島素的β細(xì)胞。利用直接重編程產(chǎn)生神經(jīng)元的德國美因茲古藤堡大學(xué)科學(xué)家Benedikt Berninger說，“就在你的眼前觀察這些細(xì)胞改變它們的身份是非常神奇的。”

相對于對iPS細(xì)胞的研究，對直接重編程的研究還處于更加初始的階段，但是它正激發(fā)人們對再生醫(yī)學(xué)的興趣。直接重編程的細(xì)胞可能比通過iPS細(xì)胞中間階段產(chǎn)生的細(xì)胞更加安全，這是因?yàn)楹笳呖赡芎卸嗄苄约?xì)胞而具有與腫瘤細(xì)胞一樣的廣泛增殖能力，這會使得它們潛在地導(dǎo)致癌癥產(chǎn)生。

基于iPS細(xì)胞的臨床介入必需謹(jǐn)慎地開展以便確保沒有多能性細(xì)胞與*成熟的細(xì)胞一起移植。瑞典隆德大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)家Malin Parmar---希望利用直接重編程逆轉(zhuǎn)帕金森病患者大腦中的神經(jīng)元丟失---說，“風(fēng)險(xiǎn)就是你可能失去對這些細(xì)胞的控制，它們在移植后開始不受控制地增殖。但是，如果你繞過iPS細(xì)胞產(chǎn)生階段，那么它更加快速和潛在地更加安全。”

改變遺傳程序

重寫細(xì)胞身份首先需要理解這些身份是如何建立的。體內(nèi)的每個細(xì)胞都能追蹤它的祖先到單個起源：受精卵。當(dāng)胚胎細(xì)胞分裂和成熟時，它們的命運(yùn)是由發(fā)育過程中特異性的基因開啟和關(guān)閉所確定的。被稱作轉(zhuǎn)錄因子的蛋白首先結(jié)合到基因組中的某些DNA序列，隨后激活或抑制附近的基因，從而調(diào)節(jié)這一過程。控制一種發(fā)育中的細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)常被稱作主調(diào)節(jié)因子（master regulator），這是因?yàn)樗鼈兛刂茝?fù)雜的一連串基因活性。

哈佛干細(xì)胞研究所細(xì)胞生物學(xué)家Qiao Zhou說，“這些主調(diào)節(jié)因子基本上都是根據(jù)它們在胚胎發(fā)生時產(chǎn)生某些細(xì)胞類型中的關(guān)鍵性作用來決定的。一個祖細(xì)胞（progenitor cell）可能能夠變成細(xì)胞A、B或C，但是如果你迫使它表達(dá)某種主調(diào)節(jié)因子，它將不可避免地選擇變成細(xì)胞A。”

證實(shí)主調(diào)節(jié)因子能夠用于直接重編程的早期研究可追溯到1987年，那一年，來自弗雷德-哈金森癌癥研究中心的Harold Weintraub、Andrew Lassar和他們的同事們證實(shí)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)某一DNA片段能夠讓它進(jìn)入變成肌肉細(xì)胞的發(fā)育途徑；他們隨后發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致這種變化的單個基因編碼轉(zhuǎn)錄因子MyoD[2]。加州大學(xué)舊金山分校格拉斯通心血管疾病研究所心臟發(fā)育研究員Deepak Srivastava說，“這在當(dāng)時是一項(xiàng)性的發(fā)現(xiàn)，也因此這個領(lǐng)域的人們曾認(rèn)為大多數(shù)其他類型的細(xì)胞會有一種關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，該因子發(fā)揮如此強(qiáng)大的作用而足以改變細(xì)胞的命運(yùn)。”

但是事情并不是這么簡單。尋找單個能夠啟動重編程的主調(diào)節(jié)因子會導(dǎo)致多年的沮喪，直到山中伸彌揭示出有效重編程的秘密并不是單個因子，而是多種基因的組合。隨著研究人員混合和搭配不同的主調(diào)節(jié)因子組合，成功的故事開始不斷涌現(xiàn)。

2008年，哈佛大學(xué)科學(xué)家Douglas Melton團(tuán)隊(duì)（Zhou是該團(tuán)隊(duì)的一員）將一種類型的胰腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化為另一種產(chǎn)生胰島素的胰腺β細(xì)胞，其中β細(xì)胞是很多糖尿病患者所需要的。Zhou說，“我們的研究作出結(jié)論：你僅需三種主調(diào)節(jié)因子實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。”2010年，斯坦福大學(xué)干細(xì)胞科學(xué)家Marius Wernig領(lǐng)導(dǎo)的一個團(tuán)隊(duì)也利用三種基因?qū)⒊衫w維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。對這項(xiàng)研究進(jìn)一步優(yōu)化和擴(kuò)展可產(chǎn)生一系列不同的特化神經(jīng)元，其中每種神經(jīng)元產(chǎn)生截然不同的神經(jīng)遞質(zhì)信號，或者對這些不同的信號作出反應(yīng)。

迄今為止，大多數(shù)開創(chuàng)性的直接重編程發(fā)現(xiàn)都是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的。但是若能夠在體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的話，很多研究人員就會對再生醫(yī)學(xué)抱有更加大的希望。在一種器官中相對豐富的細(xì)胞群體可能能夠轉(zhuǎn)化為更加迫切需要的其他類型的成熟細(xì)胞。迄今為止，研究人員已在動物實(shí)驗(yàn)中取得一些成就。比如，Parmar團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)通過將攜帶編碼重編程因子的基因的病毒載體注射進(jìn)小鼠大腦中能夠?qū)⑸窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性的神經(jīng)元。Srivastava也類似地在心臟內(nèi)將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為跳動的心肌細(xì)胞，這一策略可能提供一種治療心臟病發(fā)作導(dǎo)致的心臟損傷的方法。他說，“你擁有已經(jīng)存在于器官中的大量細(xì)胞群體，你能夠?qū)⑺鼈冇糜谠偕?rdquo;但是，迄今為止，還沒有人在人體內(nèi)嘗試過直接重編程。

身份危機(jī)

到目前為止，大多數(shù)研究著重關(guān)注確保重編程過程成功。鑒于一種細(xì)胞類型的身份是由多種基因決定的，研究人員不僅不得不成功地找出啟動這些基因的主調(diào)節(jié)因子組合：理想上，他們也不得不發(fā)現(xiàn)盡可能zui小的組合。這是因?yàn)槠仁挂环N細(xì)胞表達(dá)主調(diào)節(jié)基因（master regulator gene）的zui可靠方法是運(yùn)送這些基因的額外拷貝到這種細(xì)胞中，而相比于運(yùn)送僅僅幾種基因，運(yùn)送很多種基因到細(xì)胞中是一種更加困難的技術(shù)挑戰(zhàn)。找出zui小的主調(diào)節(jié)基因組合需要一番艱苦跋涉：通常，潛在的組合名單是比較巨大的，*的篩選方法就是系統(tǒng)性地逐一測試。比如，Parmar團(tuán)隊(duì)以12種候選基因開展產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元的研究，經(jīng)過一番篩選后，zui終將它縮小到2種基因。

一些研究人員已開始設(shè)計(jì)專門用于直接重編程的軟件，該軟件整入關(guān)于哪些主調(diào)節(jié)因子控制組織形成的信息。一個橫跨三個大洲的團(tuán)隊(duì)已開發(fā)出一種被稱作Mogrify的實(shí)驗(yàn)規(guī)劃工具，這個工具將來自眾多細(xì)胞類型的大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)與不同主調(diào)節(jié)因子控制的基因網(wǎng)絡(luò)方面的規(guī)則匯集在一起[4]?；谶@些數(shù)據(jù)和規(guī)則，Mogrify可被用來預(yù)測將導(dǎo)致所需的細(xì)胞身份變化的重編程因子組合。這就為研究人員提供一種方法在計(jì)算上鑒定出盡可能zui少的主調(diào)節(jié)基因組合，這一組合能夠?qū)⒁环N特定類型的細(xì)胞直接重編程為另一種特定類型的細(xì)胞。

但是提供有活性的主調(diào)節(jié)基因并不足以確保*的重編程：這些主調(diào)節(jié)基因可能成功地將細(xì)胞設(shè)置在一個發(fā)育途徑上，但是會讓它處于一種未成熟的前體細(xì)胞狀態(tài)。因此接下來的任務(wù)就是鑒定出其他的哪些基因必須處于活性狀態(tài)來完成這一發(fā)育過程。

中國北京大學(xué)干細(xì)胞生物學(xué)家鄧宏魁（Hongkui Deng）教授多年來努力解決這個問題。他剛開始努力通過只誘導(dǎo)主調(diào)節(jié)基因表達(dá)將皮膚細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。在第二輪篩選時，他又鑒定出能夠完成這種重編程的其他基因[5]。他將它們稱為成熟因子（maturation factor），即在啟動轉(zhuǎn)化時并不發(fā)揮重要作用但在獲得功能性的成熟細(xì)胞中起著至關(guān)重要作用的基因。

其他研究人員已發(fā)現(xiàn)他們能夠利用在促進(jìn)重編程的細(xì)胞信號通路中發(fā)揮作用的化學(xué)物擴(kuò)大主調(diào)節(jié)基因的效應(yīng)，從而提高直接重編程的成功效率，有時化學(xué)物獨(dú)自也能夠促進(jìn)細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換。

即便使用合適的基因和化學(xué)衍生物也難以證實(shí)一種直接重編程是否是真正完成的。利用顯微鏡進(jìn)行觀察能夠揭示出一種轉(zhuǎn)化是否發(fā)生---比如，扁平的星形的成纖維細(xì)胞是否形成長長的軸突狀突出，但是也需要對細(xì)胞的內(nèi)部運(yùn)作進(jìn)行更加深入的分析。簡而言之，一個人如何確保皮膚細(xì)胞經(jīng)重編程后是否真正地變成神經(jīng)元，而不只是神經(jīng)元類似物？

檢測主調(diào)控基因的下游活性能夠?qū)?xì)胞重編程如何好地成功完成提供深入認(rèn)識。如果導(dǎo)入的主調(diào)控基因確實(shí)發(fā)揮作用的話，它們應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞核中的全局基因表達(dá)模式發(fā)生重大的變化，那么哪種變化應(yīng)當(dāng)匹配在靶組織的成熟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)模式呢？有幾種方法研究細(xì)胞的全局基因表達(dá)，比如，對細(xì)胞中的所有RNA分子進(jìn)行測序。來自波士頓大學(xué)和哈佛大學(xué)的研究人員已利用這種類型的測序數(shù)據(jù)開發(fā)一種能夠評估重編程細(xì)胞中的基因活性如何好地匹配靶基因中的基因活性的軟件程序CellNet[6]。

然而，真正重要的細(xì)胞身份測試是重編程細(xì)胞是否在功能上能夠替換自然分化的細(xì)胞。德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)生物學(xué)家Chun-Li Zhang說，“如果它們看起來像是神經(jīng)元，而且它們的基因表達(dá)也類似于神經(jīng)元，那么這并不意味著它們是真正的神經(jīng)元。”令人信服的證據(jù)需要接受一系列評估，比如利用電生理學(xué)測量證實(shí)一種新形成的神經(jīng)元是否放電，因而是否能夠激活與它通過突觸連接在一起的其他神經(jīng)元。Zhou說，沒有一種特征性的評估方法能夠獨(dú)自地提供足夠說服力的證據(jù)。他的團(tuán)隊(duì)將肝細(xì)胞重編程為胰腺β細(xì)胞的努力只產(chǎn)生功能異常的中間物。他說，“它們合成和釋放大量的胰島素---如此之多以至于動物死于低血糖癥。”這是因?yàn)樗鼈內(nèi)狈σ认偌?xì)胞檢測血糖水平并對它作出反應(yīng)的能力。

這些測試的一大發(fā)現(xiàn)是在靶器官內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞重編程通常要比在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中表現(xiàn)得更好。Srivastava說，“當(dāng)在塑料材料上時，我們細(xì)胞中的大多數(shù)經(jīng)過重編程后只是部分地變成心肌細(xì)胞。但是在它們的天然環(huán)境中，它們中的絕大多數(shù)進(jìn)入跳動的狀態(tài)，并且與它們的周圍細(xì)胞在電學(xué)上偶聯(lián)在一起。”這可能是因?yàn)槠鞴僦械钠渌車?xì)胞產(chǎn)生的化學(xué)信號，或者是因?yàn)樵谌S組織環(huán)境中的特征很難在實(shí)驗(yàn)室中再現(xiàn)。無論出于何種原因，它很好地預(yù)示著臨床應(yīng)用開發(fā)。

通往臨床應(yīng)用之路

研究人員同意在這些方法能夠在人體內(nèi)測試之前，還有很多障礙要克服。一般而言，已證實(shí)相比于小鼠細(xì)胞，人細(xì)胞在進(jìn)行直接重編程時更加充滿挑戰(zhàn)：它們傾向于花費(fèi)更長時間經(jīng)歷這個重編程過程，而且雖然一些轉(zhuǎn)錄因子足以在動物實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)直接重編程，但是人細(xì)胞經(jīng)常需要額外的轉(zhuǎn)錄因子。

基因轉(zhuǎn)運(yùn)也帶來巨大的挑戰(zhàn)，特別是將基因轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)大腦等器官中。在一些情形下，偏好感染特定細(xì)胞類型的病毒能夠有助引導(dǎo)重編程因子進(jìn)入特定的患病或損傷位點(diǎn)，但是運(yùn)送到不需要的位點(diǎn)可能仍然會帶來風(fēng)險(xiǎn)。

不過，還會存在拆了東墻補(bǔ)西墻的問題。在大腦中，將神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元會降低那里的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，而這本身可能就產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。Berninger說，“這些細(xì)胞不是裝飾門面。它們也發(fā)揮重要的功能，但是如果我們把它們拿走了，我們該如何替換它們呢？”一種可能性就是細(xì)胞在經(jīng)重編程后進(jìn)入一種增殖性的---但非致瘤性的---神經(jīng)祖細(xì)胞（neural progenitor）狀態(tài)。那樣的話，一些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可能能夠產(chǎn)生大量的神經(jīng)元。

心臟治療很可能zui接近于臨床應(yīng)用。Srivastava團(tuán)隊(duì)已開始研究將豬心臟內(nèi)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞。他說，“我們有初步的概念驗(yàn)證：即便在像我們這樣的大的心臟中，我們也能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化的效果。”如今，這個團(tuán)隊(duì)正在開展安全性研究，而且正在優(yōu)化他們的基因運(yùn)送方法，以便實(shí)現(xiàn)獲得監(jiān)管部門批準(zhǔn)用于人體臨床試驗(yàn)的目標(biāo)。重要的是，心臟成纖維細(xì)胞能夠自我補(bǔ)充，因此對細(xì)胞丟失的擔(dān)憂并不那么嚴(yán)重。

Zhou團(tuán)隊(duì)努力將體外培養(yǎng)的人胃腸道細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞，并且也正在努力在診所中開展應(yīng)用。這些腸道細(xì)胞很容易通過活組織檢查獲得，而且在體外培養(yǎng)和重編程后，在理論上，它們能夠移植到患有糖尿病的志愿者的胰腺中。

直接重編程正開始獲得產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注，不過生物技術(shù)公司和制藥公司并沒有準(zhǔn)備好全心全意地投入其中。盡管從某種意義上說，對iPS細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的研究有先行一步的優(yōu)勢，但是隨著細(xì)胞類型直接轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢日益突出，這一差距可能會被填平。Zhou說，“迄今為止，還沒有同等數(shù)量的資源和人力投入到這種方法中。但是這個領(lǐng)域正在快速趕上，我迫不及待地想看到它將會如何發(fā)展。