以下是?大鼠骨特異性堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒?的實(shí)驗(yàn)使用說明書，綜合操作流程、注意事項(xiàng)及技術(shù)要點(diǎn)：

　　BS-3487  大鼠骨特異性堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒

　　一、實(shí)驗(yàn)原理?

　　采用?雙抗體夾心法?：

　　包被微孔板的大鼠ALP捕獲抗體與樣本中的ALP結(jié)合?。

　　加入HRP標(biāo)記的檢測抗體，形成“抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物?。

　　TMB顯色，顏色深淺與ALP濃度正相關(guān)，450nm測OD值?。

　　二、樣本處理?

　　血清/血漿?：

　　采集后3000rpm離心10-20分鐘，避免溶血?。

　　抗凝劑可選EDTA、肝素或檸檬酸鹽?。

　　組織勻漿?：

　　加入PBS勻漿，3000rpm離心10分鐘取上清?。

　　細(xì)胞上清液?：

　　離心去除顆粒，避免反復(fù)凍融?。

　　保存?：

　　短期存于2-8℃，長期需-20℃保存，避免多次凍融?。

　　三、操作步驟?

　　標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?：

　　按說明書梯度稀釋(如40IU/L→2.5IU/L)?。

　　加樣?：

　　空白孔不加樣，標(biāo)準(zhǔn)孔加50μl標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔先加40μl稀釋液+10μl樣本(5倍稀釋)?。

　　溫育?：

　　37℃孵育30分鐘，封板膜密封?。

　　洗滌?：

　　用稀釋后的洗滌液洗板5次，拍干?。

　　加酶標(biāo)抗體?：

　　每孔50μl(空白孔除外)，37℃復(fù)育30分鐘?。

　　顯色與終止?：

　　依次加入顯色劑A/B各50μl，避光顯色15分鐘，終止液50μl終止反應(yīng)?。

　　檢測?：

　　450nm測OD值，15分鐘內(nèi)完成?。

　　四、注意事項(xiàng)?

　　試劑準(zhǔn)備?：

　　使用前平衡至室溫(15-30分鐘)，濃縮洗滌液需37℃助溶?。

　　加樣精度?：

　　使用校準(zhǔn)加樣器，避免孔壁接觸，5分鐘內(nèi)完成加樣?。

　　質(zhì)量控制?：

　　每次實(shí)驗(yàn)需做標(biāo)準(zhǔn)曲線及復(fù)孔，樣本OD值超標(biāo)準(zhǔn)曲線時需稀釋?。

　　干擾因素?：

　　避免使用NaN3(抑制HRP活性)或高脂樣本?。

　　五、結(jié)果計算?

　　以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制曲線，擬合方程計算樣本ALP濃度?。

　　以上操作需嚴(yán)格遵循試劑盒說明書，不同批次可能存在差異?。

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