熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽488(綠色)

產(chǎn)品貨號(hào)：G0059  

Abs/Em (nm)：490/515

存儲(chǔ)溫度：-20℃干燥、避光保存，有效期見(jiàn)外包裝。若配制成水溶液，應(yīng)小量分裝保存。

注意事項(xiàng)

本產(chǎn)品為凍干粉形式，微量不易觀察，使用前請(qǐng)瞬時(shí)離心，加適當(dāng)溶劑溶解后使用，溶解后的溶液近乎透明色。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

鬼筆環(huán)肽是從致命的傘形毒蕈蘑菇中分離出來(lái)的一種毒素。 它是特異性結(jié)合于 F-肌動(dòng)蛋白的雙環(huán)肽。因此用熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以非常方便的研究 F-肌動(dòng)蛋白的分布。鬼筆環(huán)肽內(nèi)部，在半胱氨酸和色氨酸之間含有不常見(jiàn)的硫醚橋形成內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。在pH 升高時(shí)，該硫醚被裂解，鬼筆環(huán)肽失去對(duì)肌動(dòng)蛋白的親和力。

熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可在納摩爾水平染色F-肌動(dòng)蛋白。在各種植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中，標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)大、小細(xì)絲具有相似的親和力，平均每個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基結(jié)合一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子。不同于抗體，鬼筆環(huán)肽與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合親和力在不同物種間沒(méi)有顯著變化。非特異性染色可以忽略不計(jì)，染色和未染色區(qū)域之間的對(duì)比度非常大。鬼筆環(huán)肽將單體/聚合物的平衡轉(zhuǎn)向聚合狀態(tài)，將聚合臨界濃度降低至30倍。Phallotoxins可通過(guò)抑制細(xì)胞松弛素的解聚， 碘化鉀和升高的溫度，穩(wěn)定 F-肌動(dòng)蛋白，。因?yàn)楣砉P環(huán)肽綴合物很小，大約直徑12-15埃，分子量<2000道爾頓，多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，包括肌球蛋白，原肌球蛋白和后肌鈣蛋白依然可以和鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白結(jié)合。更重要的是， 鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲保持功能，標(biāo)記甘油肌纖維仍然收縮，標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲仍然可以繼續(xù)移動(dòng)。而且熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可用于對(duì)細(xì)胞中 F-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行定量研究。

實(shí)驗(yàn)方法

儲(chǔ)液制備

熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽：取適量甲醇或無(wú)菌水溶解棕色管中凍干的粉末，制備成200 T/mL的儲(chǔ)液（300T規(guī)格染料加入1.5 mL的液體，50T規(guī)格染料加入0.25 mL的液體即可）。

熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽的一個(gè)單位（T）的定義是染色一個(gè)加載細(xì)胞的載玻片所用染料的量。 對(duì)于熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，使用時(shí)的推薦稀釋比例為1:40-1:200，一個(gè)單位相當(dāng)于200 μL總?cè)旧w積中加入1-5 μL 200T/mL儲(chǔ)備溶液。

注：稀釋比例可以根據(jù)實(shí)際染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

固定細(xì)胞染色

以下方案是針對(duì)生長(zhǎng)在玻璃蓋玻片或8孔室玻片上的貼壁細(xì)胞的染色步驟。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片。

1. 用PBS清洗細(xì)胞3次。

2. 用含有3.75％甲醛的PBS溶液固定細(xì)胞，冰上固定15 min。

注意：甲醇可以在固定過(guò)程中破壞肌動(dòng)蛋白。因此最hao避免含有任何甲醇的固定劑。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

3. 用PBS清洗細(xì)胞3次。

4. 用含0.5％Triton X-100的PBS溶液在室溫下透化細(xì)胞10 min。

5. 用PBS清洗細(xì)胞3次。

6. 用200μL PBS稀釋1-5 μL熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽儲(chǔ)液，加入一個(gè)蓋玻片或孔中，室溫孵育20min，進(jìn)行染色。

注：染色體積可根據(jù)樣本情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。孵育過(guò)程中為避免染液揮發(fā)，可將蓋玻片放于密封容器內(nèi)。

7. 用PBS清洗細(xì)胞2-3次。

8. 熒光顯微鏡觀察。標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽具有很好的光穩(wěn)定，樣品可以在PBS中成像，但為了效guo最jia，也可以使用抗熒光淬滅劑觀察。

活細(xì)胞染色

熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽不具有細(xì)胞透性，因此沒(méi)有被廣泛用于活細(xì)胞標(biāo)記。然而，有報(bào)道稱(chēng)活細(xì)胞可能通過(guò)胞飲或未知機(jī)制進(jìn)行標(biāo)記。一般來(lái)說(shuō)，染色活細(xì)胞時(shí)需要更多的染料?；蛘?，熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可被注入到細(xì)胞中用于監(jiān)測(cè)肌動(dòng)蛋白分布和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。