T4 DNA Ligase(Fast)

產(chǎn)品貨號(hào)：T5205-200U

儲(chǔ)存條件：-20℃

產(chǎn)品組成

注：1U=1 Weiss unit

產(chǎn)品簡介

T4 DNA Ligase(Fast)由攜帶T4噬菌體gene30的大腸桿菌產(chǎn)生。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA、RNA或者DNA/RNA復(fù)合物間可修復(fù)單鏈缺刻，并且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但對(duì)于單鏈核酸無活性，主要用于限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物DNA片段克隆、基因定點(diǎn)突變與PCR產(chǎn)物克隆、修復(fù)雙鏈DNA缺刻與線性DNA自環(huán)化。T4 DNA Ligase(Fast)需要ATP作為輔助因子，在室溫下完成粘性末端連接反應(yīng)僅需10分鐘。

酶活單位定義

37℃條件下，1 Weiss unit的酶在20min內(nèi)催化1nmol的[PPi]轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚蕴课綉B(tài)。1 Weiss unit等同于約200個(gè)粘性末端連接反應(yīng)單位（CEU），相當(dāng)于在16℃條件下，30min內(nèi)連接50% HindIII消化后的λDNA片段。

酶活檢測條件

酶活在如下反應(yīng)混合物中進(jìn)行測試：66mM Tris-HCl(pH7.6)，6.6mM MgCl，0.066mM ATP，10mM DTT，3.3μM[32PPi]。

質(zhì)量控制

核酸量內(nèi)控切酶制殘留測試

37℃條件下，將200U的T4 DNA Ligase(Fast)與1ug的pUC19DNA中溫育4h，未檢測出共價(jià)閉合環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閹в腥笨痰腄NA。

核酸外切酶殘留檢測

將酶液與雙鏈DNA底物在37℃溫育16h，通過DNA電泳檢測雙鏈DNA底物無變化。

藍(lán)白斑測試

室溫條件下，使用30U T4 DNA Ligase連接pUC57 DNA/HindIII，pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化產(chǎn)物1h，然后用E.coli XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，檢測到少于1%的白斑。

使用方法

1.DNA插入片段連接至載體DNA（粘性末端連接）

1）于冰上配制如下反應(yīng)體系：

2）充分混勻并瞬離，22℃溫育10min；

3）取1~5ul的連接產(chǎn)物用于50ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2ul用于50ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。

2.DNA插入片段連接至載體DNA（平末端連接）

1）于冰上配制如下反應(yīng)體系：

2）充分混勻并瞬離，22℃溫育1h；

3）取1~5ul的連接產(chǎn)物用于50ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2ul用于50ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。

1. 線性DNA自環(huán)化

1）于冰上配制如下反應(yīng)體系：

2）徹di混勻并瞬離，22℃溫育10min；

3）取1~5ul的連接產(chǎn)物用于50ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2ul用于50ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。

2.接頭連接

雙鏈寡核苷酸接頭經(jīng)常被用于在插入片段上產(chǎn)生粘性末端。接頭通常包含限制酶識(shí)別位點(diǎn)，在連接后經(jīng)酶切處理產(chǎn)生和克隆載體匹配的粘端。有時(shí)候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端，此時(shí)無需在接頭連接完成后進(jìn)行插入片段的進(jìn)一步處理。

1）于冰上配制如下反應(yīng)體系：

2）徹di混勻并瞬離，22℃溫育10min；

3）在65℃作用10min或者70℃作用5min，進(jìn)行熱失活。

注：添加1mM ATP的條件下，T4 DNA Ligase(Fast)在LabFD™酶切緩沖液中具有100%活性。因此，接頭連接反應(yīng)時(shí)可以在LabFD™酶切緩沖液中進(jìn)行，以簡化“接頭連接-酶切”實(shí)驗(yàn)流程。具體方法為：接頭連接反應(yīng)完成后，先失活T4 DNA Ligase，然后向該體系中添加ATP至終濃度1mM，再在體系中加入適量的LabFD™快速內(nèi)切酶，最后使用最適酶切反應(yīng)溫度進(jìn)行溫育即可。

注意事項(xiàng)

1）T4 DNA Ligase在濃度高于200mM的NaCl或KCl中會(huì)被強(qiáng)烈抑制；

2）連接反應(yīng)液添加量不應(yīng)該超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%，不推薦體系中加入過量的T4 DNA Ligase；

3）與T4 DNA Ligase結(jié)合的DNA可能會(huì)在瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)帶移或彌散，為了避免此現(xiàn)象，可以在上樣前對(duì)酶進(jìn)行熱失活，必要時(shí)加入適量的SDS；

4）聚乙二醇（PEG）能極大地提高平末端連接的連接效率，PEG8000的推薦添加量是連接體系的5%（w/v）；

5）電轉(zhuǎn)化效率可能通過對(duì)T4 DNA Ligase熱失活或者使用離心柱或者氯仿抽提純化DNA方式來提高；

6）轉(zhuǎn)化子數(shù)目可通過延長反應(yīng)時(shí)間至1h而增加。