| 參考價(jià) | ￥ 15500 |
| 訂貨量 | ≥1件 |
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分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑及耗材的銷售，包括核酸提取、PCR產(chǎn)品、血清、細(xì)胞培養(yǎng)耗材等產(chǎn)品。
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100 Reactions |
|---|---|---|---|
| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥 |
貨號(hào)： HG-PG001
PG13細(xì)胞系是由小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH/3T3）整合莫洛尼氏白血病毒（MLV）表達(dá)載體和長(zhǎng)臂猿白血病病毒（GALV）胞膜蛋白基因改造而獲得的。PG13細(xì)胞作為一種包裝細(xì)胞目前主要應(yīng)用于細(xì)胞產(chǎn)品（如CAR-T/TCR-T細(xì)胞等）的開發(fā)。因此相關(guān)生物制品需要對(duì)其進(jìn)行PG13細(xì)胞DNA殘留的含量進(jìn)行檢測(cè)。
本試劑盒配套有PG13 DNA定量參考品可快速準(zhǔn)確定量檢測(cè)各種生物制品的中間品、半成品和成品中PG13殘留DNA。
配套樣品前處理試劑盒（貨號(hào)為HG-CL100）進(jìn)行樣品的前處理。
檢測(cè)范圍：3 fg/μL ~ 3×105 fg/μL
100 Reactions
| 組分 | 規(guī)格 | 存儲(chǔ)條件 |
|---|---|---|
| PG13 DNA 定量參考品（30ng/μL） | 50μL×1 管 | -20℃ |
| PG13 Primer&Probe Mix | 550μL×1管 | -20℃ |
| 2x qPCR Reaction Buffer | 1.6mL×1 管 | -20℃ |
| DNA稀釋液 | 1.5mL×3 管 | -20℃ |
存儲(chǔ)條件見(jiàn)上表，有效期12個(gè)月。開封后未使用完的試劑盒注意仍在規(guī)定儲(chǔ)存條件下保存。
◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)準(zhǔn)備好下列耗材與設(shè)備：
◆1.5mL或2mL無(wú)菌低吸附離心管
◆ 與PCR儀適配的96孔qPCR板或八聯(lián)排管
◆ 1000μL，200μL，10μL無(wú)菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 熒光定量PCR儀
◆ 水浴鍋/金屬浴
◆ 離心機(jī)
◆ 震蕩器
◆ 各規(guī)格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架
詳見(jiàn)樣品前處理試劑盒（貨號(hào)為HG-CL100）操作說(shuō)明書。
1. 定量參考品及NCS、NTC的制備
1.1 定量參考品：取出 PG13 DNA 定量參考品、DNA 稀釋液置于冰上融化；待完i全融化后，輕微振蕩混勻，瞬時(shí)離心；
1.2 取 7 支干凈的 1.5mL 離心管，分別標(biāo)記為 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6；
1.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過(guò)程如下表
| 標(biāo)準(zhǔn)品代號(hào) | 稀釋體積 | 濃度(fg/μL) |
| ST0 | 10μL PG13 DNA定量參考品 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 106 |
| ST1 | 10μL ST0 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 105 |
| ST2 | 10μL ST1 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 104 |
| ST3 | 10μL ST2 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 103 |
| ST4 | 10μL ST3 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 102 |
| ST5 | 10μL ST4 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 101 |
| ST6 | 10μL ST5 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 100 |
1.4 NTC 的制備：100uL DNA 稀釋液；
1.5 NCS 的制備：取 100uL DNA 稀釋液與樣品同時(shí)進(jìn)行前處理，純化洗脫后的產(chǎn)物即為 NCS；
1.6 加標(biāo)回收 ERC：建議 90uL 樣品 +10uL ST3，也可根據(jù)實(shí)際情況按照其他方式制備。
2. q-PCR 反應(yīng)液的制備和加樣
2.1 根據(jù)所需檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品數(shù)量（一般做 3 個(gè)復(fù)孔），計(jì)算所需孔數(shù)：
反應(yīng)孔數(shù) =（6 個(gè)濃度梯度的標(biāo)曲 +2 個(gè)陰性對(duì)照 NTC 和 NCS + 待測(cè)樣品）×3
2.2 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 qPCR Mix 總量：
qPCR Mix=（反應(yīng)孔數(shù) +2 或 3）× 20μL（2 或 3 為操作損失量）
2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示配制 qPCR Mix。
| 組分 | 單孔反應(yīng)(μL) |
| 2x qPCR Buffer | 15 |
| PG13 Primer&Probe Mix | 5 |
| 總體積 | 20 |
qPCR Mix配制表
3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按表4所示加樣（總體積30μL）：
| 參考品 | 20μL qPCR Mix +10μL ST1/2/3/4/5/6 |
| 陰性對(duì)照 | 20μL qPCR Mix +10μL NTC/NCS |
| 待測(cè)樣品 | 20μL qPCR Mix +10μL 待測(cè)樣本 |
各反應(yīng)孔加樣示例
4.實(shí)驗(yàn)需使用qPCR實(shí)驗(yàn)專用的八聯(lián)管或者96孔板進(jìn)行反應(yīng)，需去除反應(yīng)體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準(zhǔn)備反應(yīng)。
5.反應(yīng)孔排版示例
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | ST1 | ST1 | ST1 | S1 | S1 | S1 | ||||||
| B | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | S2 | S2 | ||||||
| C | ST3 | ST3 | ST3 | S3 | S3 | S3 | ||||||
| D | ST4 | ST4 | ST4 | |||||||||
| E | ST5 | ST5 | ST5 | |||||||||
| F | ST6 | ST6 | ST6 | ERC -S1 | ERC -S1 | ERC -S1 | ||||||
| G | NTC | NTC | NTC | ERC -S2 | ERC -S2 | ERC -S2 | ||||||
| H | NCS | NCS | NCS | ERC -S3 | ERC -S3 | ERC -S3 |
96孔板排版示例
（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）
1.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)程序，設(shè)置兩步法反應(yīng)程序如下表：
| Stage1 | 預(yù)變性 | Reps:1 | 95℃ | 30s |
| Stage2 | 循環(huán)反應(yīng) | Reps:40 | 95℃ | 5s |
| 56℃ | 34s |
2.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板，點(diǎn)擊Select Fluorophores選擇熒光FAM；在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為PG13-DNA；輸入每個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)及Sample Name。(備注：如儀器要求設(shè)置猝滅基團(tuán)與參比熒光：猝滅基團(tuán)為None，參比熒光為ROX。)
3.在反應(yīng)板圖表中，選擇標(biāo)曲孔，在Sample Type中下拉選擇Standard，勾選熒光FAM，Target Name命名為PG13DNA；輸入每個(gè)稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及Sample Name。分別在ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6的Concentration一欄賦值為3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02、3.00E+01、3.00E+00（單位為fg/μL）。
4.點(diǎn)擊Run界面“Start Run”按鈕進(jìn)行PCR測(cè)定。
以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點(diǎn)擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴(kuò)增效率（Effect）、R2。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無(wú)模板對(duì)照NTC、NCS、待測(cè)樣本的檢測(cè)值，單位為fg/μL。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評(píng)估：
• 三個(gè)平行孔間Ct值差應(yīng)小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對(duì)照NTC和NCS的CT值都應(yīng)大于標(biāo)曲最i低濃度的CT值或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身驗(yàn)證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，擴(kuò)增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標(biāo)回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。
1. 本試劑盒已通過(guò)穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證，無(wú)需分裝。
2. 陰性樣品和陽(yáng)性樣品（參考品和待測(cè)樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個(gè)區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴
好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時(shí)更換吸頭，避免交叉污染，避免長(zhǎng)時(shí)開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。
5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。
6. 只有嚴(yán)格遵守說(shuō)明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測(cè)效果。
7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測(cè)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。
9. 公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，
預(yù)留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。
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現(xiàn)貨供應(yīng)：公司庫(kù)存充足，可快速發(fā)貨，減少用戶等待時(shí)間。
效期保障：嚴(yán)格把控產(chǎn)品質(zhì)量，確保試劑效期新鮮，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
專業(yè)技術(shù)支持：提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)指導(dǎo)，幫助用戶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高實(shí)驗(yàn)成功率。
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