6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6 - phosphogluconate dehydrogenase， 6-PGDH）說明書

分光光度法 50 管/48 樣

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶 輔酶Ⅱ

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

磷酸戊糖途徑途徑中 6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）和 6PGDH 依次催化NADPH 合成，與能量的平衡、生長速率和細(xì)胞活力等密切相關(guān)。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。

測(cè)定原理：

6PGDH 催化 6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH，NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而NADP+沒有；通過測(cè)定 340nm 吸光度增加速率，計(jì)算 6PGDH 活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1ml 石英比色皿和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解；在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

取 1ml 石英比色皿，依次加入 50μl 樣本和 950μl 試劑一，于 340nm 處測(cè)定 3min 內(nèi)吸光值變化，第 10 s

吸光值記為A1，第 190s 吸光值記為A2?！鰽=A2-A1

注意：空白管只需要做一次。

6PGDH 活性計(jì)算公式

1、血清（漿）6PGDH 活力的計(jì)算:

單位的定義：每 ml 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

6PGDH（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=1071.8×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 6PGDH 活力的計(jì)算:

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1071.8×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1071.8×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.536×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000 萬。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶 輔酶Ⅱ