紅霉su-N-脫甲基酶（Erythromycin N-demethylase，ERND）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

紅霉su-N-脫甲基酶試劑盒P450

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的酶系，在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物的代謝，具有重要作用。ERND 在P450 酶系中相當(dāng)于CYP2B 亞型，與藥物代謝的去甲基化密切相關(guān)。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用，也可使某些藥物經(jīng)CYP2B 代謝活化。

測(cè)定原理：

ERND 催化紅霉su釋放甲醛，通過 Nash 比色測(cè)定甲醛含量，即可計(jì)算出 ERND 活性。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 50 ml 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 2.6 ml 蒸餾水，充分溶解。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 2.6 ml 蒸餾水，充分溶解。試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前，加蒸餾水 9 ml 充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶，-20℃保存。臨用前取 1.5 ml EP 管，加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)液，加 990μl 蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)甲quan溶液，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1ml 玻璃比色皿、蒸餾水和冰。

粗酶液提?。?/span>

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。

測(cè)定操作：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

對(duì)照管：取 1 支EP 管，加入 50μl 粗酶液，850μl 試劑二，50μl 試劑三，50μl 蒸餾水，混勻后置于 37℃水浴保溫 30min；立即加入 175μl 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取出后加入 175μl 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取新的EP 管，加入 500μl 上清液，500μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測(cè)定光吸收，記為A 對(duì)照管。

測(cè)定管：取 1 支EP 管，加入 50μl 粗酶液，850μl 試劑二，50μl 試劑三，50μl 試劑四，混勻后置于 37℃

水浴保溫 30min；立即加入 175μl 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取出后加入 175μl 試劑六，混勻后室

溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取 1 支新EP 管，加入 500μl 上清液，500μl 試劑七，混勻后 60℃

水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測(cè)定光吸收，記為A 測(cè)定管。

標(biāo)準(zhǔn)管：取 1 支EP 管，加入 500μl 標(biāo)準(zhǔn)品，500μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測(cè)定光吸收，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。

ERND 活性計(jì)算公式：

(1) 按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（W×V樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml，需要另外測(cè)定；V 樣：加入粗酶液體積，50μl=0.05ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，30min。

紅霉su-N-脫甲基酶試劑盒P450