“XXXX”動(dòng)物外周血單核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0025SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】適用儀器：zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

【檢驗(yàn)方法】全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

  方法一（需留取血漿備用）

1首先取抗凝血 250g 離心 10min，棄血漿，補(bǔ)加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積，選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)。

2取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：  1。如細(xì)胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量zui少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

3用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定 離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到zui 佳分離效果）。

4離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層。*層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層（第 一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。

5用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)2010X1118），混勻細(xì)胞。

6 250g，離心 10min。

7棄上清。

8用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

9 250g，離心 10min。

10重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。分離圖例

方法二（不需血漿留存?zhèn)溆茫?/span>

1根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總 量與抗凝血體積比為 2：1。如抗凝血為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量zui低不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

2用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。

3離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層（*層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。

4后續(xù)步驟同方法一。

【差異貼壁法純化細(xì)胞】

（1）用單核細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：CTBD2011）或單核細(xì)胞*培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：HCTBD2011）以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。

（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。

（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

   注：

a)無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。

b)*培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

c)由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰性分選。

【注意事項(xiàng)】

1全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

2本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

3如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭?/span>.

 【儲(chǔ)存條件及有效期】

  常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟封后置常溫保 

  存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)單核細(xì)胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

1所獲得單核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

2所獲得單核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

3所獲得單核細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

2本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

3本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

  注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，離

  心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。