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| 加速紅細胞沉降法 利用高分子量的聚合物促使紅細胞凝聚成串錢狀，從而加速紅細胞沉降，使 | |||||||||
| 之與白細胞分離。 | |||||||||
| 常用的高分子聚合物有明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及甲基纖維素等。 | |||||||||
| （1） 試劑及配制 | |||||||||
| 3%明膠（灝洋生物產(chǎn)）（粘度為25泊以上）：選取明膠，用生理鹽水配成3%溶液，置沸水 | |||||||||
| 浴加熱溶解，分裝，高壓蒸汽滅 | |||||||||
| 菌8磅15-20min. | |||||||||
| 6%右旋糖酐（灝洋生物產(chǎn)）（分子量200-400KD）：用生理鹽水配制。 | |||||||||
| 操作方法分為2種。 | |||||||||
| *種：①取抗凝靜脈血加入等量3%明膠鹽水溶液中，混勻或用3份血液與1份3%明膠溶液混 | |||||||||
| 勻；②將試管直 | |||||||||
| 立靜置室溫或37℃溫箱中30-60min,利用明膠與紅細胞的粘合作用，促使紅細胞快速下沉，而白 | |||||||||
| 細胞留在明膠溶液 | |||||||||
| 中；③用毛細吸管吸取富含白細胞的上層液，移入另一試管中；④按自然沉降法④-⑤操作。 | |||||||||
| 第二種：①取1份右旋糖酐溶液加等量抗凝血，混勻；②按操作方法1的②-④操作。 | |||||||||
| 外周血單個核細胞分離試劑：（聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法） | |||||||||
| 外周血中單個核細胞（PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形狀和比重與其他細胞不同， | |||||||||
| 紅細胞和多核 | |||||||||
| 細胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細胞和單核細胞比重為1.075左右。利用比重1.077左右的分 | |||||||||
| 層液作密度梯度 | |||||||||
| 離心，使一定比重的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。 | |||||||||
| 1．試劑及配制 | |||||||||
| ⑴聚蔗糖泛影葡胺分層液（LTS1077）：（灝洋生物有成品供應），比重為1.077±0.001 | |||||||||
| ⑵臺盼藍染液：稱取4g臺盼藍，于研缽中用少量雙蒸水研磨，加雙蒸水至100ml ,1500r/min離心 | |||||||||
| 15min,吸出上層液， | |||||||||
| 即為4%水溶液。用前，1.8%氯化鈉溶液1倍，即為2%臺盼藍染液。 | |||||||||
| 2.操作方法 | |||||||||
| ⑴取靜脈血放入抗凝管，搖允，用Ph7.2-7.6 Hank 液稀釋血液1-2倍。 | |||||||||
| ⑵取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分層液（灝洋生物產(chǎn)）3-4ml,放入15X150mm試管中。 | |||||||||
| ⑶用毛吸管吸取稀釋血液，在離分層液上1cm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于分層液 | |||||||||
| 上，稀釋血液與 | |||||||||
| 分層液體積比例約為2：1。 | |||||||||
| ⑷用水平離心機以2000r/min離心30min,離心后管內(nèi)容物分為三層，上層為血漿（內(nèi)含血小板）， | |||||||||
| 中間層為分層液， | |||||||||
| 底層為紅細胞和多核白細胞。在上、中層液體界面處可見到乳白色渾濁的單個核細胞層。 | |||||||||
| ⑸用毛細吸管輕輕插到白膜層，沿試管壁周緣吸取界面層單個核細胞，移入另一試管中。 | |||||||||
| ⑹加5倍以上體積不含Ca2+、Mg2+Hank液，混勻，1500r/min離心10min,吸棄上清，重復洗滌2次。 | |||||||||
| ⑺末次離心后，吸盡上清。按每毫升血液標本加0.2ml含20%小牛血清Hank液重新混懸細胞。取1 | |||||||||
| 滴細胞懸液置血 | |||||||||
| 6 | |||||||||
| 球計數(shù)板內(nèi)計數(shù)。然后細胞濃度調(diào)節(jié)至2X10 /ml | |||||||||
| ⑻細胞活力檢測：取1滴細胞懸液加1滴2%臺盼藍染液混勻，加蓋片，顯微鏡高倍鏡檢?；罴毎?/td> | |||||||||
| 不著色，折光強； | |||||||||
| 死細胞被染成藍色，體積略膨大?；罴毎麛?shù)應在95%以上。 | |||||||||
| 3．注意事項 | |||||||||
| ⑴用稀釋后的全血可是單個核細胞得率高，將稀釋的血液疊加于分層液上時，一定要細心，動作 | |||||||||
| 要輕，避免沖散 | |||||||||
| 分層液面或與分層液混合而影響分離結(jié)果。 | |||||||||
| ⑵配制單個核細胞懸液所用的培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用，并對細胞無毒性。 | |||||||||
| ⑶吸取單個核細胞時，應避免吸出過多上清液或分層液而導致血小板污染。 | |||||||||
| ⑷配制好的單個核細胞可放室溫或0-4℃，后一條件較好，可減低細胞代謝活動。注意不要迅速 | |||||||||
| 改變其所出的溫 | |||||||||
| 度，以免造成“溫度”休克。 | |||||||||
| 通用型細胞分離液（LTS1130） 的比重的配方（灝洋生物產(chǎn)） | |||||||||
| 取比重LTS1077的人淋巴細胞分離液（灝洋生物產(chǎn)） 3ml ,放入15X150mm試管中。 | |||||||||
| 用PBS將肝素抗凝血稀釋1-2倍后，將稀釋全血加到LTS1077分離液上，稀釋的血液：分離液約為 | |||||||||
| 2：1。 | |||||||||
| 用水平離心機以1500r/min離心10min,離心后，單個核細胞位于血漿和分離液的界面層，紅細胞和 | |||||||||
| 粒細胞沉淀在 | |||||||||
| 分離液層下，一部分單核細胞和血小板位于分離液層上。 | |||||||||
| 吸取界面單個核細胞層，用PBS洗三次。 | |||||||||
| 用適當?shù)呐囵B(yǎng)液重疊單個核細胞，配成所需濃度的細胞。 | |||||||||
| 用臺盼藍拒染法檢查細胞活力。 | |||||||||
| NK細胞分離試劑：細胞分離液不連續(xù)梯度分離法 | |||||||||
| 通用型細胞（LTS1130）分離液，為無毒、無刺激的新型密度梯度離心分離劑。其在離 | |||||||||
| 心過程中會自然 | |||||||||
| 形成密度梯度，從而將不同密度的細胞分離出來。 | |||||||||
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