病毒分離
分離病毒是診斷病毒性疾病zui常用，并且高度敏感的方法之一。分離出的病毒須經(jīng)免疫
學、基因分析或電子顯微鏡等進一步鑒定確診。病毒可長期保存，亦可用來作抗原性、
基因特性或藥物敏感性等分析。病毒分離亦受一定限制。目前用于分離病毒的組織細胞
種類有限，每種細胞只能用來分離培養(yǎng)一或數(shù)種病毒。MDCK（狗腎細胞）是目前用于分
離培養(yǎng)流感病毒zui常用的細胞系。
分離流感病毒zui常用的活體是雞胚，目前有些實驗室用MDCK細胞代替雞胚分離培養(yǎng)流感
病毒。由于MDCK細胞屬腫瘤細胞系，故用該細胞分離的病毒不能用于疫苗生產(chǎn)。各實驗
室應同時采用雞胚和MDCK兩種方法分離病毒，不應放棄用雞胚分離病毒的方法。

流感病毒細胞分離標準操作規(guī)程

材料：1、細胞瓶或細胞管培養(yǎng)成片的MDCK細胞
2、TPCK處理胰酶（牛胰腺來源XIII型）Sigma Cat. # T-8642
3、HEPES 緩沖液, 1 M 母液 GIBCO BRL Cat. # 15630-023
4、D-MEM培養(yǎng)基，GIBCO BRL Cat. # 11965-092
5、青、鏈霉素母液（10,000 U/ml 青霉素 G; 10,000 ?g/ml 硫酸鏈霉素） ，GIBCO BRL
Cat. # 15140-023
6、牛血清白蛋白組分V, 7.5%溶液，GIBCO BRL Cat. # 15260-011
7、放置于2ml wheaton 小瓶中的臨床樣品
8、T-25培養(yǎng)瓶用于病毒培養(yǎng)，（組織培養(yǎng)管也可被應用，若樣本量大的話應選用培養(yǎng)瓶
，細胞數(shù)量按規(guī)定調(diào)整。）
9、1ml 滴管
10、10ml 滴管
培養(yǎng)基和試劑的準備：（建議：要求經(jīng)常檢查試劑使用的有效期）
500 ml D-MEM液中加入：
青、鏈霉素母液5 ml （終濃度達: 100 U/ml 青霉素and 100 ?g/ml 鏈霉素）
牛血清白蛋白12.5 ml （終濃度: 0.2 %）
HEPES緩沖液12.5 ml （終濃度: 25 mM）
病毒生長液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶（母液濃度為2m
g/ml ）使TPCK-胰酶的濃度為2 ?g/ml。
方法：（所有有關病毒分離的操作都應在生物安全Ⅱ?qū)嶒炇抑羞M行，必須遵守生物安全
規(guī)定，嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定。進入生物安全Ⅱ?qū)嶒炇乙笾匾?br />個人防護用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防護眼鏡）

程序：
Ⅰ 細胞培養(yǎng)瓶的準備
1、顯微鏡檢查細胞生長狀態(tài)，40倍放大。
2、用病毒培養(yǎng)液替代細胞生長液，保證使用合適的病毒培養(yǎng)基。
3、輕輕倒出細胞生長液于廣口瓶中，用6 ml of含2 ?g/ml of TPCK-胰酶的D-MEM液洗細
胞3遍。
Ⅱ 細胞培養(yǎng)瓶的接種
1、用無菌的移液管將D-MEM從細胞培養(yǎng)瓶中移出。
2、用無菌的移液管吸取200 ?l臨床樣品置于細胞培養(yǎng)瓶中。
3、接種物370C吸附30分鐘。
4、加6 ml of含2 ?g/ml of TPCK-胰酶的不含小牛血清的*D-MEM液于細胞培養(yǎng)瓶中。

5、每細胞培養(yǎng)物的收獲日檢測細胞病變。（細胞病變的特征是細胞腫脹圓化，細胞間隙
增大。細胞核固縮或破裂。嚴重時細胞部分或全部脫落）
Ⅲ 細胞培養(yǎng)物的收獲
1、當細胞病變?yōu)?+或4+時，收獲細胞懸液并加穩(wěn)定劑如：甘油或終濃度為0.5%的牛血清
白蛋白。即使無細胞病變也應該于6-7天收獲。
2、進行紅細胞凝集實驗并40C保存。如沒有紅細胞凝集現(xiàn)象在報告不能從樣品中分離病
毒前，應再傳代2-3次。
3、如果有必要，應3000轉(zhuǎn)離心5分鐘以去除剩余的細胞。通過血凝抑制實驗鑒定分離物
，并在收獲的一天間將分離物保存在-70oC條件。

流感病毒雞胚分離標準操作規(guī)程
材料：雞胚10日齡
照卵燈
70%酒精
針頭, 22 號, 1? 英寸
1ml注射器
雞卵開孔器
膠水或清漆
15ml 管和架子
10ml 移液管
無菌鑷子
方法：（所有有關病毒分離的操作都應在生物安全Ⅱ?qū)嶒炇抑羞M行，必須遵守生物安全
規(guī)定，嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定。進入生物安全Ⅱ?qū)嶒炇乙笾匾?br />個人防護用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防護眼鏡）
程序：
I.驗卵
1、用照卵燈檢測雞胚，并將雞胚的盲端放置在蛋盤上。
2、如果雞胚是沒有受精、有裂痕、發(fā)育不全、或表面有好多滲水孔，應掉。
II.雞胚接種
1、將雞胚的盲端放置在蛋盤上，標記每個雞胚用特定的鑒定數(shù)量（通常每個樣本接種3
個雞胚）。
2、用70%乙醇消毒雞胚，在氣室端鉆孔。每份標本接種3個雞胚。
3、用注射器吸1ml處理過的臨床標本，裝上22 號（ 1? 英寸）針頭。
4、將雞胚置于蛋架上，用短促動作刺破雞胚羊膜，將100 ?l臨床標本注入雞胚羊膜腔。
將針頭退出至? 英寸，將另外100 ?l臨床標本注入雞胚尿囊腔。
5、用同一注射器和針頭將同一標本依上法接種另外的兩枚雞胚。
6、將針頭棄于合適的生物安全裝置中。
7、滴石蠟或膠水封口。
8、33-34oC 溫箱培養(yǎng)雞胚2-3 天。
提示：禽流感需35?C or 37oC培養(yǎng)，哺乳動物流感病毒35oC培養(yǎng)（禽流感在35?C也會生
長良好！）
III.雞胚收獲
1、雞胚在收獲前應4oC過夜或至少放置4小時。
2、標記15ml 塑料管與相應的雞胚編號一致。用70%乙醇消毒雞胚頂部。
3、用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開雞胚尿囊膜。用10ml 吸管吸雞胚尿囊液置于相
應的收集管中。用注射器和針頭刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水放置于另外的管中。由于
羊水較少可以將3個雞胚的羊水合并。
4、將雞胚收獲液3000轉(zhuǎn)離心5分鐘去除血液和細胞。進行紅細胞凝集實驗并4oC孵育30分
鐘。如沒有紅細胞凝集現(xiàn)象在報告不能從樣品中分離病毒前，應再雞胚傳代2次。
5、如果有必要，應3000轉(zhuǎn)離心5分鐘以去除剩余的細胞。通過血凝抑制實驗鑒定分離物
，并在收獲的一天間將分離物保存在-70oC條件下。
注意事項
I.不要在-20oC條件下保存病毒分離物，應該溫度條件下流感病毒極不穩(wěn)定。
II.流感病毒實驗室毒株和臨床檢測樣本的交叉污染問題：流感病毒操作要求生物安全規(guī)
程。當在同一工作區(qū)域內(nèi)操作臨床樣本和已知流感病毒時應該有特殊警示。有些實驗室
用已知的病毒作為陽性控制，而且有將商用推薦病毒作為質(zhì)量確證程序。這些病毒由于
其極優(yōu)的生長特性被選擇出來。因此這些毒株常與臨床檢測樣本發(fā)生交叉污染。在
流感流行季節(jié)前準備該類病毒。如果在此期間必須補充這類病毒的話，必須與處理臨床
標本的時間分開。應盡量將已知病毒和未知材料在不同時間、不同生物安全柜、不同房
間進行操作。
：
III.實驗室污染的鑒定：由于試驗室已知毒株和商用推薦病毒都是實驗室適應的，有良
好的生長特性，通常滴度較高。用推薦血清做抗原分析和基因序列分析可以確定污染狀
況。

重要原則：
禁止在同一實驗室，同一時間處理接種未知臨床標本和已知標準病毒。
禁止在同一實驗室，同一時間處理接種采自不同動物的標本；動物標本（如豬、禽等）
必須與人的標本分別保存。