(1)細(xì)胞培養(yǎng)常見問題與解答

問：我看到培養(yǎng)板有4、6、12、24、48、96孔幾種規(guī)格 ，但不知道到底什么實(shí)驗(yàn)用哪種規(guī)格。
答：要根據(jù)你具體的實(shí)驗(yàn)要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，細(xì)胞爬片一般用24孔等，要具體根據(jù)你實(shí)驗(yàn)來定。

問：請(qǐng)問哪位高手知道Terasaki板是什么培養(yǎng)板，與普通細(xì)胞培養(yǎng)板有什么區(qū)別？
答：Terasaki plate主要是用于晶體學(xué)研究，產(chǎn)品設(shè)計(jì)便于對(duì)晶體的觀察與結(jié)構(gòu)分析。有兩種sitting 和handingdrop兩種方法，兩種方法應(yīng)用產(chǎn)品的外形結(jié)構(gòu)也不同。材料上選擇crystal class polymer，特殊的材料有利觀察晶體結(jié)構(gòu)。
細(xì)胞培養(yǎng)板主要是PS材料。材料是treated sufface。便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)與伸展。當(dāng)然還有浮游細(xì)胞的生長(zhǎng)材料，同時(shí)還有l(wèi)owbinding surface，有關(guān)更多實(shí)驗(yàn)材料上的應(yīng)用與對(duì)材料的選擇。

問：我想測(cè)吸光度用酶標(biāo)儀，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板行嗎？請(qǐng)問酶標(biāo)板 多孔細(xì)胞培養(yǎng)板有什么區(qū)別？
答：用多空細(xì)胞培養(yǎng)板測(cè)吸光度肯定可以拉，我們經(jīng)常用它來做樣品的蛋白定量和MTT檢測(cè)。
區(qū)別：酶標(biāo)板一般要比細(xì)胞培養(yǎng)板貴，細(xì)胞板主要做細(xì)胞培養(yǎng)，但也可以用來測(cè)蛋白濃度；酶標(biāo)板包括包被板和反應(yīng)板，一般不能用做細(xì)胞培養(yǎng)，它主要做免疫酶聯(lián)反應(yīng)后的蛋白檢測(cè)，它需要更高的要求還需要特定的酶標(biāo)工作液。常用不同培養(yǎng)板的孔底面積及推薦加液量：不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范圍，結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量。若加液量過多會(huì)影響氣體（氧氣）交換，而且在搬動(dòng)過程中易溢出造成污染。具體所加細(xì)胞密度依實(shí)驗(yàn)的目的不同靈活掌握。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)板的密閉和污染問題
細(xì)胞培養(yǎng)板的加樣和操作：細(xì)胞培養(yǎng)板在進(jìn)行細(xì)胞操作時(shí)同樣遵循嚴(yán)格無菌的原則，各項(xiàng)操作要保證規(guī)范、科學(xué)，不對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)造成額外的影響。這其中zui常見的問題就是如何保證加樣后細(xì)胞的均勻和盡量減少換液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。

問：96，24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松，這樣是方便了透氣，但是細(xì)菌、霉菌等污染物會(huì)不會(huì)也隨著溜進(jìn)去呢？
答：1.蓋子很松，屬于半開放培養(yǎng)，這樣的目的是透氣（實(shí)際上是為了使培養(yǎng)皿外的co2能夠與培養(yǎng)皿充分交換，維持培養(yǎng)基的pH值）。
2.凡事有利必有弊，這樣當(dāng)然增加了污染的可能性。此外這樣還會(huì)使培養(yǎng)皿內(nèi)的液體蒸發(fā)，這對(duì)于定量的藥物來說就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的a培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須清潔（定期紫外線照，酒精擦洗，盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱）b培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必須始終保持為100%（培養(yǎng)箱內(nèi)放置無菌蒸餾水的水槽）。
就好像培養(yǎng)皿，也是一個(gè)蓋倒扣的容器，也不會(huì)污染。主要是因?yàn)樯w子“L"型邊緣產(chǎn)生氣流負(fù)壓的緣故，灰塵上面才附著有微生物，而氣流攜帶的灰塵是無法通過產(chǎn)生負(fù)壓的蓋邊緣的。而透氣作用只是通過空氣的擴(kuò)散，不會(huì)產(chǎn)生氣流，所以只會(huì)透氣不會(huì)透菌。
我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作(在超凈臺(tái)內(nèi))，而其它孔中還有細(xì)胞要培養(yǎng).我很擔(dān)心這樣會(huì)污染，不知道要注意什么?大家不知道有什么好的建議。
在超凈臺(tái)內(nèi)如果操作規(guī)范的話應(yīng)該可以的，我想你可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子，盡量只暴露要操作的孔，將其它孔用蓋子蓋起來。這是我的一點(diǎn)粗淺的見解，拋磚引玉吧！
使用前綜合考慮一下，充分使用所以的孔；如果只需要使用少數(shù)的孔可以只用一邊的，其余用蓋子蓋住，我習(xí)慣于先用右側(cè)的孔（右手加樣方便）。
其實(shí)自己感覺只要注意無菌操作，一般是不會(huì)污染的。操作時(shí)用幾塊玻片把板子一側(cè)墊高，不要把蓋子全打開，一般沒問題。

(3)細(xì)胞分布不均及解決辦法

問：我的細(xì)胞接種培養(yǎng)板，細(xì)胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊？我看園子里有的戰(zhàn)友的細(xì)胞卻是聚集在中間，是不是板子的質(zhì)量問題?。?br>答：請(qǐng)問你的細(xì)胞是如何混勻的？是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板？如果是后者，而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話，很有可能由于離心力的作用使細(xì)胞甩到周邊部分，導(dǎo)致細(xì)胞中間少，四周多！自己可是試試！
周邊一般是相對(duì)會(huì)多一點(diǎn)，但是中間的數(shù)量也不會(huì)很少啊~~ 鋪板的時(shí)候我也沒有特異去振蕩培養(yǎng)板。
大概是板子的質(zhì)量問題吧或者是不是鋪板時(shí)候的細(xì)胞密度太低了？我用的corning的板 。
一個(gè)好辦法：在你培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)的飽和后再取出，種入細(xì)胞時(shí)力量要輕，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細(xì)胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細(xì)胞基本是均勻生長(zhǎng)。記住千萬不要用振蕩器振蕩，否則你的細(xì)胞就會(huì)想你說得那樣聚積在一起。
我今天把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里幾個(gè)小時(shí)，適當(dāng)?shù)陌鸭?xì)胞密度加大了一下，另外多加了一點(diǎn)培養(yǎng)液，今晚看細(xì)胞鋪的挺好的。我認(rèn)為有兩種可能解決你問題的辦法:1.加入前吹打均勻;2.從多孔板側(cè)邊或底邊緩慢加入。

問：我在做原代培養(yǎng)時(shí)也遇到過這種情況，我一直以為培養(yǎng)皿鋪膠不均勻會(huì)導(dǎo)致這種現(xiàn)象，因?yàn)榛靹虻难芏渭尤氲脚囵B(yǎng)皿中時(shí)，在相差顯微鏡下血管段均勻分布在培養(yǎng)皿中，24h后貼壁的血管段就是周邊多，中間相對(duì)少些。下次我要試試hkqu戰(zhàn)友的方法看能否改變這種現(xiàn)象。

答：這種現(xiàn)象很正常呀，不知你仔細(xì)觀察過沒有，孔直徑愈小，這個(gè)現(xiàn)象越明顯，我試過，24、96孔板這種現(xiàn)象不可避免，因?yàn)橐后w的附壁使得孔內(nèi)培養(yǎng)液不是成一個(gè)液平面，而是周邊高，就像凹鏡一樣，而使用這兩種孔板由于需要加干預(yù)等原因而不能加足量培養(yǎng)液，使得細(xì)胞隨培養(yǎng)液一起出現(xiàn)“邊集"現(xiàn)象，如果為了使孔中央也有均勻細(xì)胞而增加接種細(xì)胞數(shù)量的話，這要看你需要觀察何種指標(biāo)，如果是MTT，免疫組化的話會(huì)因?yàn)榧?xì)胞成層而影響結(jié)果。

(4)6孔板接種和換液?jiǎn)栴}：
問：我的細(xì)胞傳代很正常，但一種到六孔板里（不管加藥和對(duì)照），總有兩三個(gè)孔（隨機(jī)）細(xì)胞長(zhǎng)得不好，很小，像破碎了。有人遇到過這種情況嗎？到底是啥原因呢？請(qǐng)各位指點(diǎn)
答：可能跟你加液的溫度有關(guān)。如果你細(xì)胞剛剛拿出來換液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來不久，很容易細(xì)胞就會(huì)凍死了。建議你把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。
另外，跟你細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細(xì)胞可以用高點(diǎn)的血清濃度培養(yǎng)。保證細(xì)胞狀態(tài)良好。
或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問題，你再換換其它培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細(xì)胞狀態(tài)問題了，種板時(shí)的血清濃度調(diào)高試一下

問：zui近幾天，我用六孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，在更換培養(yǎng)基之前，顯微鏡觀察到細(xì)胞貼壁，狀態(tài)非常的好，更換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)每個(gè)孔中都近乎有一半的細(xì)胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細(xì)胞變得非常小，產(chǎn)生大量的碎片，而另一半的細(xì)胞一切正常，異常細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在一條分水嶺，上半個(gè)圓是好的，下半個(gè)圓就不好，這是怎么一回事？

答：你可以看一下是不是培養(yǎng)板沒放水平。有一回我也出現(xiàn)過這種情況。
你的培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過期，細(xì)胞就不會(huì)貼壁。換一點(diǎn)新配制的培養(yǎng)液試一試。
我也經(jīng)常碰到，我想可能是板的問題，換一個(gè)牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題了。
不知樓主所需換液的培養(yǎng)板多不多，換培養(yǎng)基的時(shí)候如果沒有注意風(fēng)機(jī)的影響，特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時(shí)，容易使細(xì)胞因風(fēng)吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時(shí)應(yīng)該逐個(gè)培養(yǎng)板進(jìn)行，別怕浪費(fèi)吸管，注意操作的效率！

(5)24孔板接種問題：
問：把細(xì)胞消化接種到24孔板之后，已經(jīng)四天了，老是每孔的中間部分長(zhǎng)不滿，每天換液時(shí)都用PBS清洗，第二天換液時(shí)都出現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊緣長(zhǎng)的很好，中央大量死細(xì)胞？

答：我是選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片，在玻片上種植。每次換液都用PBS洗，必要的步驟嗎？另外，也有可能和細(xì)胞種類有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)？
我想你的培養(yǎng)液可能加的太少了。由于表面張力的作用，培養(yǎng)板的邊緣液體會(huì)向上走，造成培養(yǎng)液面呈現(xiàn)一個(gè)凹面（就像量筒的液體凹面一樣），中央的細(xì)胞正好在凹面的zui低處，培養(yǎng)液少，細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)不夠，甚至干涸掉，空氣中的氧氣也會(huì)造成損傷，即使有增值過來的細(xì)胞也會(huì)死掉。
另外，檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了，如果少了，箱內(nèi)的空氣濕度不夠，會(huì)造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快，這樣即使剛加的液體不少，過一段時(shí)間，由于蒸發(fā)，液體量會(huì)減少，造成中央干涸。并且這樣會(huì)改變了培養(yǎng)液的成分濃度，造成滲透壓過高。
個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為這是物理問題:24孔板小，細(xì)胞接種進(jìn)去后是很難搖均勻的，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞重貼壁后呈現(xiàn)四周密中間稀的狀況.至于中間較多死細(xì)胞，如果是懸浮狀的話，也一樣是物理問題。接種后比較粗暴的碰撞，似乎對(duì)搖均勻細(xì)胞有一定效果.

在為多孔板培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)一定要注意，不要把培養(yǎng)基吸得太干，如果*吸取，很容易造成細(xì)胞干涸，這樣的話細(xì)胞會(huì)很快死亡。我有一段時(shí)間總是遇到這個(gè)問題，一個(gè)板子中總有一兩個(gè)孔出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡，后來發(fā)現(xiàn)是上面的原因?，F(xiàn)在我做的時(shí)候如果必須把液體吸干，我會(huì)一個(gè)一個(gè)空來吸取，zui多一次不超過3孔，然后馬上加入液體，同時(shí)在作轉(zhuǎn)染時(shí)，我會(huì)在吸液和加液時(shí)將風(fēng)機(jī)關(guān)掉，這樣基本上會(huì)避免細(xì)胞死亡。

同時(shí)你所說的細(xì)胞周圍密而中間稀疏，大約有如下原因：
1.培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問題。
2.細(xì)胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導(dǎo)致細(xì)胞分布到周圍。

細(xì)胞分布均勻與否有一點(diǎn)很關(guān)鍵，即每種細(xì)胞是有個(gè)體差異的，別人的細(xì)胞操作不一定適合于你.所以要靠自己摸索，且找出專屬于自己細(xì)胞的一套規(guī)律，有如下經(jīng)驗(yàn)：
1.所有待接種的細(xì)胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。
2.按資料記載，24孔板的液體量為1ml，個(gè)人也覺得1ml的量足矣。
3.接種時(shí)，要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭，這樣做對(duì)細(xì)胞均勻分布有一定效果。
4.接種后直接放入培養(yǎng)箱讓細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)板這個(gè)新的環(huán)境，個(gè)人認(rèn)為沒有必要在室溫放置一段時(shí)間。
5.根據(jù)細(xì)胞的特性，細(xì)胞均喜歡聚集在邊緣生長(zhǎng)，所以我考慮到，你的問題還有可能是接種時(shí)的細(xì)胞密度不夠，導(dǎo)致周邊密集，中間稀疏的錯(cuò)覺。你的拌種密度是多少？
另"要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭"的意思就是:加樣不能太快，避免細(xì)胞在一個(gè)加樣處聚集，且注意在不同的部位進(jìn)行加樣，即邊加邊活動(dòng)槍頭，人為使細(xì)胞趨于均勻分布，我個(gè)人覺得有一定的效果，不知這次我解釋清楚沒有。