藥敏試驗(yàn)方法及不同菌類(lèi)選擇藥敏紙片指南

藥敏試驗(yàn)方法：
K-B法：
1 從孵育了16-24小時(shí)的瓊脂平板上（血平板），挑出單個(gè)菌落，直接用生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?/span>
2 在15分鐘內(nèi)，用無(wú)菌棉拭子蘸取調(diào)好的菌液，在液面上方管壁處旋轉(zhuǎn)并用力擠壓幾次，以從中擠出過(guò)多的菌液。
3 用棉拭子在無(wú)菌的M-H培養(yǎng)基表面化線接種，再重復(fù)操作兩次，每次將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60度，每次接種都應(yīng)保證接種物均勻分布，zui后用棉拭子涂抹平板的邊緣。
4 將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面。每個(gè)紙片都應(yīng)壓一下，以保證與平板表面*接觸。每個(gè)紙片中心間距24mm。紙片一旦與平板接觸，不應(yīng)再移動(dòng)。
5 貼完紙片后，應(yīng)在15分鐘內(nèi)放入35度孵箱。嗜血桿菌屬，鏈球菌屬放入3%-5%的CO2燭缸。
6 孵育24小時(shí)以后，測(cè)量各藥敏紙片抑菌圈直徑，與NCCLS手冊(cè)比較，作出結(jié)果判斷。 
說(shuō)明：細(xì)菌藥敏結(jié)果的判斷以NCCLS為標(biāo)準(zhǔn)，所以藥敏試驗(yàn)的每一步都應(yīng)嚴(yán)格按照NCCLS操作，否則將失去意義。鏈球菌、奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌、除銅綠假單孢菌和不動(dòng)桿菌外的假單孢菌屬不用K-B法.            
肺炎鏈球菌膠乳凝集測(cè)定法
1 在一干凈玻片上分別滴兩滴生理鹽水。
2 從冰箱取出鑒定試劑(Slidex pneumo-kit)于室溫。
3 在其中一滴生理鹽水上滴加R1試劑，在另外一滴上滴加R2試劑，用攪拌棒混勻。
4 輕輕晃動(dòng)玻片2分鐘，觀察結(jié)果。
5 2分鐘內(nèi)，如R1出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性；如R1和R2均未出現(xiàn)凝集為陰性。
注：R3為陽(yáng)性對(duì)照。
藥敏紙片的選擇
1、革蘭陰性桿菌（腸桿菌科）
頭孢噻肟（CTX）頭孢唑林（CZ）頭孢他定（CAZ）
氨芐西林（AM） 哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）
頭孢噻吩（CF）環(huán)丙沙星（CIP）頭孢呋辛（CXM）
慶大霉素（GM）頭孢噻肟/棒酸（CTX/CA）
頭孢他定/克拉維酸（CAZ/CA）羧芐青霉素（CB）
奧格門(mén)?。ˋMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）
亞安培南 頭孢匹肟（FEP） 頭孢克羅（CEC）
2、銅綠假單孢菌/不動(dòng)桿菌
妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）
頭孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）頭孢匹肟
頭孢噻肟（CTX）環(huán)丙沙星（CIP）頭孢他定（CAZ）
左旋氧氟沙星（OFL）亞安培南 哌拉西林/三唑巴坦
3、金黃色葡萄球菌
苯唑西林（OX）青霉素G（P）頭孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）
紅霉素（E）頭孢噻肟（CTX）環(huán)丙沙星（CIP）
萬(wàn)古霉素 奧格門(mén)?。ˋMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦
頭孢噻吩（CF） 
4 、腸球菌
氨芐西林（AM）萬(wàn)古霉素 環(huán)丙沙星（CIP）
慶大霉素（GM）紅霉素（E） 氧氟沙星（OFL）
5、除肺炎鏈球菌外鏈球菌
氨芐西林（AM）頭孢噻肟（CTX）萬(wàn)古霉素
紅霉素（E） 氧氟沙星（OFL）克林霉素(CM)
肺炎克雷伯菌產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸桿菌ESBLs的檢測(cè)
  MH培養(yǎng)基上貼頭孢他定，頭孢他定/克拉維酸，頭孢噻肟/棒酸，安曲南。
如頭孢他定的抑菌圈<22mm，安曲南<27mm，頭孢噻肟<27mm，意味可能有ESBLS產(chǎn)生。
如頭孢他定/克拉維酸與頭孢他定，頭孢噻肟/棒酸與頭孢噻肟的差值≥5mm，則確證ESBLS產(chǎn)生。
耐藥機(jī)制。
  一代頭孢對(duì)普通變形桿菌、枸櫞酸桿菌、腸球菌、假單孢菌屬、沙雷氏菌屬、擬桿菌屬無(wú)效。第二代頭孢對(duì)假單孢菌屬、不動(dòng)桿菌屬、沙雷氏菌屬、腸球菌無(wú)效；腸球菌對(duì)頭孢類(lèi)天然耐藥。氨基糖甙類(lèi)抗生素阿米卡星與慶大霉素不*交叉耐藥。紅霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)等抗生素內(nèi)部有相互交叉耐藥。
  金黃色葡萄球菌耐萬(wàn)古霉素、無(wú)乳鏈球菌耐青霉素和氨芐青霉素、無(wú)乳鏈球菌和D群鏈球菌耐萬(wàn)古霉素和替拉考寧為不可能的表型。
  洋蔥伯克霍德菌對(duì)氨基糖甙類(lèi)、亞安培南天然耐藥。
  除表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌外，替拉考寧耐藥的凝固酶陰性的葡萄球菌不常見(jiàn)。
  金黃色葡萄球菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥為罕見(jiàn)表型。
氨芐青霉素對(duì)非發(fā)酵類(lèi)不宜應(yīng)用。
對(duì)于葡萄球菌，苯唑西林耐藥，青霉素敏感是不可能的。
NCCLS關(guān)于細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)的說(shuō)明
總評(píng)論：
1、頭孢噻吩可以代表頭孢噻吩、頭孢匹林、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢克洛、和頭孢羥氨芐。但是，頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢丙烯應(yīng)單獨(dú)測(cè)試，因?yàn)槟承?duì)這些藥物敏感的菌株對(duì)頭孢噻吩是耐藥的。
2、利福平不能單獨(dú)用于化療。
腸桿菌科 
1對(duì)于沙門(mén)菌屬和志賀菌屬只有氨芐西林、喹諾酮、和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑可用于常規(guī)試驗(yàn)與報(bào)告。初此之外，對(duì)于沙門(mén)菌屬和志賀菌屬的腸道外分離株，應(yīng)測(cè)試并報(bào)告氯霉素和一種三代頭孢菌素。
2、克雷伯菌屬和大腸艾希菌的產(chǎn)ESBLS株對(duì)青霉素、頭孢菌素類(lèi)或安曲南臨床治療可顯耐藥性，盡管在體外藥敏試驗(yàn)對(duì)其中某些抗生素敏感。對(duì)于所有產(chǎn)ESBLs株，應(yīng)報(bào)告為耐所有青霉素類(lèi)、頭孢菌素及安曲南。
3、隨著3代頭孢菌素的治療，腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬和沙雷菌屬可發(fā)展其耐藥性。zui易敏感的菌株在開(kāi)始治療3-4天就可變?yōu)槟退?，因此要反?fù)測(cè)試這些菌株。
葡萄球菌
1、   青霉素敏感的葡萄球菌對(duì)FDA批準(zhǔn)的用于葡萄球菌感染的其他青霉素類(lèi)、頭孢菌素和碳青烯類(lèi)也是敏感的。青霉素耐藥而苯唑西林敏感的菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺酶不穩(wěn)定的青霉素是耐藥的，但對(duì)其他β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定的青霉素、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥、相關(guān)的頭孢類(lèi)和卡巴陪南是敏感的。苯唑西林耐藥的葡萄球菌對(duì)現(xiàn)在可用的所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是耐藥的。因此僅測(cè)試青霉素和苯唑西林就可以推知一大批β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的敏感性與耐藥性，不必常規(guī)測(cè)試其他青霉素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抑制劑復(fù)合藥、頭孢類(lèi)和卡巴陪南類(lèi)。
2、   絕大多數(shù)的MRS對(duì)多種抗生素耐藥。包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖甙類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、克林霉素和四環(huán)素。觀察到多重耐藥應(yīng)該是對(duì)甲氧西林可能耐藥的線索。
3、   長(zhǎng)期應(yīng)用喹諾酮類(lèi)治療的過(guò)程中葡萄球菌可發(fā)展其耐藥性，因此應(yīng)重復(fù)測(cè)試耐藥性。
腸球菌
1、   對(duì)于腸球菌屬，頭孢菌素、氨基糖甙類(lèi)（除了篩選高水平耐藥性）、克林霉素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑在體外可能有活性，但臨床無(wú)效，因此不能報(bào)告細(xì)菌對(duì)這些藥物敏感。
2、   青霉素敏感性可以用于不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的腸球菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、?；逼S西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林以及哌拉西林/三唑巴坦的敏感性
3、   氨芐西林是氨芐西林和阿莫西林類(lèi)的代表藥。氨芐西林的結(jié)果可用來(lái)判斷不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的腸球菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸和氨芐西林/舒巴坦的敏感性。
4、   青霉素的結(jié)果可預(yù)測(cè)不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的腸球菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/三唑巴坦的敏感性。
5、   對(duì)于血和腦脊液分離株需用頭孢硝噻吩β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)，陽(yáng)性提示對(duì)青霉素耐藥，同時(shí)對(duì)酰胺基、羧基和脲基青霉素耐藥。
細(xì)菌鑒別要點(diǎn)
1、   革蘭陽(yáng)性球菌
所有革蘭陽(yáng)性球菌*步為觸酶試驗(yàn)。
通常觸酶陽(yáng)性為葡萄球菌和微球菌，陰性為鏈球菌科。但不排除例外，氣球菌為弱陽(yáng)性。糞腸球菌偶有陽(yáng)性。操作觸酶試驗(yàn)應(yīng)盡量避免用鉑金取菌環(huán)（針）在H2O2 上涂菌，而應(yīng)先涂菌，在滴H2O2，步驟不能顛倒。因?yàn)殂K金可以和H2O2產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。H2O2必須新鮮，若放置過(guò)久或暴露于光線下容易分解，必須保存于4℃冰箱。實(shí)驗(yàn)所用菌須大量，不可挑到瓊脂，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。
對(duì)觸酶陽(yáng)性的革蘭陽(yáng)性球菌，應(yīng)繼續(xù)做玻片法血漿凝固酶試驗(yàn)，此為檢出葡萄球菌，如陽(yáng)性一般為金黃色葡萄球菌；如陰性應(yīng)做試管法凝固酶實(shí)驗(yàn)確證，玻片法僅為篩選實(shí)驗(yàn)。血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)用血漿須用兔或豬血漿，新鮮血漿不穩(wěn)定，可能發(fā)生自我凝集或形成顆粒產(chǎn)生渾濁或產(chǎn)生沉淀而導(dǎo)致判度錯(cuò)誤；不可使用人血漿，其含有抑制物質(zhì)回干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
觸酶陰性為鏈球菌科，根據(jù)菌落溶血進(jìn)行下一步鑒定。а溶血：草綠色鏈球菌；肺炎鏈球菌；腸球菌
в溶血：A群鏈球菌；B群鏈球菌，部分D群鏈球菌
腸球菌也有不溶血菌落，不能根據(jù)溶血判斷腸球菌。鏈球菌主要實(shí)驗(yàn)：膽汁七葉苷，七葉苷，菊糖，CAMP  ，桿菌肽，高鹽，奧樸托辛，膽鹽溶解。
腸球菌為致病菌，且腸球菌與非腸球菌耐藥機(jī)制不同，應(yīng)進(jìn)行鑒別，腸球菌分為糞腸球菌和屎腸球菌；非腸球菌分為牛鏈球菌和馬鏈球菌。腸球菌對(duì)青霉素耐藥，非腸球菌對(duì)青霉素敏感。腸球菌的藥敏注意高耐氨基糖甙的細(xì)菌，如高耐氨基糖甙則意味氨基糖甙與в內(nèi)酰胺類(lèi)藥物合用無(wú)協(xié)同作用。
肺炎鏈球菌與草綠色鏈球菌鑒別：肺炎鏈球菌奧樸托辛、菊糖、膽鹽溶解實(shí)驗(yàn)皆為陽(yáng)性。但這3個(gè)實(shí)驗(yàn)都非特異，需聯(lián)合應(yīng)用方為zui宜。肺炎鏈球菌的青霉素藥敏實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意，當(dāng)青霉素（K-B法）的抑菌圈直徑大于或等于19mm時(shí)為敏感，當(dāng)小于19mm時(shí)不能確定是否中敏或耐藥，應(yīng)做MIC稀釋確證。
2、革蘭陰性桿菌
包括腸桿菌科、非發(fā)酵菌和弧菌科。
*步實(shí)驗(yàn)為氧化酶實(shí)驗(yàn)。
氧化酶陰性為腸桿菌科；陽(yáng)性為非發(fā)酵菌和弧菌科。
腸桿菌科包括大腸桿菌、變形桿菌、普羅菲登斯菌及摩根菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、多源菌屬、沙雷菌屬、耶爾森菌屬。非發(fā)酵菌包括銅綠假單孢菌、黃單孢菌、不動(dòng)桿菌等。
氧化酶實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：①需用銅綠假單孢菌做陽(yáng)性對(duì)照。
②60秒內(nèi)判讀結(jié)果有效，而以10秒內(nèi)zui宜。③不要用含微量鐵的取菌環(huán)或針，可用棉棒替代。
革蘭陰性桿菌的鑒定以API系列為國(guó)標(biāo)，其他生化管僅為常規(guī)鑒定。