人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）ELISA試劑盒

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Human Brain Derived Neurotrophic

              Facor（BDNF） ELISA Kit

                      Catalog No. CSB-E04501h

                                 （96 tests）

    This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of human

    BDNF concentrations in serum, plasma and other biological fluids.

    Expiration date   six months from the date of manufacture

    FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

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INTRODUCTION

BDNF       is  a  13    kDa,   119    amino     acid   （aa）   residue    non-glycosylated

polypeptide   whose   primary   structure   is   conserved   among   all   mammalian

species examined. Initially synthesized as a 247 aa residue prepropeptide,

the BDNF molecule is divided into an 18 aa residue signal sequence, a 110

aa residue prosequence, and a 119 aa residue mature segment. Similar to

other    neurotrophic   factors,     there   is  a  possibility  that  the   N-terminus     is

alternatively  spliced,   giving  rise   to a   longer pre-prosegment  （but  identical

mature segment） with different functional properties. As a mature molecule,

BDNF      is  52%    identical   to  NGF     at  the   amino    acid   level,  exists   as  a

noncovalently-linked        homodimer       in  solution,   and   contains    six   cysteine

residues that are believed to form three intrachain disulfide linkages. BDNF

in plasma is detected in the pg/mL

PRINCIPLE OF THE ASSAY

The     microtiter   plate  provided     in  this  kit  has  been   pre-coated      with   an

antibody   specific   to   BDNF.   Standards   or   samples   are  then   added   to   the

appropriate   microtiter   plate   wells   with   a   Horseradish   Peroxidase   （HRP）

-conjugated   antibody   preparation   specific   for   BDNF  and   incubated.   Then

substrate solutions are added to each well. The enzyme-substrate reaction

is   terminated   by   the   addition   of   a   sulphuric   acid   solution   and   the   color

change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm ± 2

nm.   The   concentration   of   BDNF   in   the   samples   is   then   determined   by

comparing the O.D. of the samples to the standard curve.

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DETECTION RANGE

0.62   ng/ml-20   ng/ml.  The   standard   curve  concentrations   used   for  the

ELISA’s were 20 ng/ml, 10 ng/ml, 4.37 ng/ml,1.87 ng/ml, 0.62ng/ml.

SPECIFICITY

This   assay   recognizes   human    BDNF.   No   significant  cross-reactivity  or

interference was observed.

SENSITIVITY

The minimum detectable dose of human BDNF is typically less than 0.31

ng/ml.

The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined

as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.

MATERIALS PROVIDED

              Reagent                                    Quantity

              Assay plate                                    1

              Standard                                  5 x 0.5 ml

              HRP-conjugate                              1 x 6 ml

              Substrate A                                1 x 7 ml

              Substrate B                                1 x 7 ml

              Stop Solution                              1 x 7 ml

   Standard            S1            S2           S3           S4          S5

 Concentration

                      0.62          1.87         4.37          10          20

    （ng/ml）

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STORAGE

1.   Unopened   test   kits   should   be   stored   at   2-8°C   upon   receipt   and   the

    microtiter plate should be kept in a sealed bag. The test kit may be used

    throughout the expiration date of the kit. Refer to the package label for

    the expiration date.

2.   Opened     test  kits  will  remain  stable   until  the  expiring  date   shown,

    provided it is stored as prescribed above.

3. A   microtiter   plate   reader   with   a   bandwidth   of   10   nm   or   less   and   an

    optical   density   range   of   0-3   OD   or   greater   at   450nm   wavelength   is

    acceptable for use in absorbance measurement.

OTHER SUPPLIES REQUIRED

     Microplate   reader   capable   of   measuring   absorbance  at   450   nm,   with

     the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.

     Pipettes and pipette tips.

     Deionized or distilled water.

     Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.

SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

     Serum     Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot

     for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove

     serum and assay immediay or aliquot and store samples at -20° C.

    Avoid repeated freeze-thaw cycles.

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     Plasma        Collect    plasma     using    citrate,  EDTA,     or   heparin    as   an

     anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes

     of collection. Assay immediay or aliquot and store samples at -20° C.

     Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.

ASSAY PROCEDURE

Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is

recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.

1.    Set a Blank well without any solution. Add 50μl of Standard or Sample

     per well.

2.    Add 50μl of HRP-Conjugate to each well （Not to Blank!）. Incubate for 1

     hour at 37°C.

3.    Aspirate each well and wash, repeating the process three times for a

     total   of   three   washes.   Wash   by   filling   each   well   with  ddH O   （200μl）

                                                                                2

     using     a  squirt   bottle,  multi-channel     pipette,   manifold     dispenser    or

     autowasher.   Complete   removal   of   liquid   at   each   step   is   essential   to

     good   performance.   After   the   last   wash,   remove   any   remaining Wash

     Buffer   by   aspirating   or   decanting.   Invert   the   plate  and   blot   it   against

     clean paper towels.

4.    Add 50μl of Substrate A and 50μl Substrate B to each well. Incubate

     for 15 minutes at 37°C. Keeping the plate away from  drafts and other

     temperature fluctuations in the dark.

5.    Add   50μl   of  Stop   Solution   to   each   well.   If   color   change   does   not

     appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.

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6.    Determine the optical density of each well within 30 minutes, using a

     microplate reader set to 450 nm.

CALCULATION OF RESULTS

Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and

subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve

by reducing the data using computer software capable of generating a four

parameter logistic （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard

curve   by   plotting   the   mean   absorbance   for   each   standard   on   the   y-axis

against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the

points on the graph. The data may be linearized by plotting the log of the

BDNF concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be

determined       by   regression    analysis.    This   procedure     will  produce     an

adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the

concentration      read   from   the  standard    curve   must   be  multiplied    by  the

dilution factor.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

      The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.

      Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.

      If samples generate values higher than the highest standard, dilute the

     samples and repeat the assay.

      Any   variation   in  operator,    pipetting   technique,    washing    technique,

     incubation   time   or   temperature,   and   kit   age   can   cause   variation   in

     binding.

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      This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors,

     binding proteins, and other factors present in biological samples. Until

     all  factors   have    been    tested   in  the   Quantikine    Immunoassay,        the

     possibility of interference cannot be excluded.

TECHNICAL HINTS

      When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.

      To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of

     each standard level, between sample additions, and between reagent

     additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.

      When   using   an   automated   plate   washer,   adding   a   30  second   soak

     period   following   the   addition   of   wash   buffer,   and/or   rotating   the   plate

     180 degrees between wash steps may improve assay precision.

      To   ensure   accurate   results,   proper   adhesion   of   plate   sealers   during

     incubation steps is necessary.

      Substrate   Solution   should   remain   colorless   until   added   to   the   plate.

     Keep Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should

     change from colorless to gradations of blue.

      Stop Solution should be added to the plate in the  same order as the

     Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue

     to   yellow   upon   addition   of   the   Stop   Solution. Wells  that   are   green   in

     color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the

     Substrate Solution.

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      人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）快速檢測試劑盒快速檢測試劑盒

      人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子                      快速檢測試劑盒快速檢測試劑盒

                              使用說明書使用說明書

                              使用說明書使用說明書

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產(chǎn)品編號產(chǎn)品編號：CSB-E04501h

產(chǎn)品編號產(chǎn)品編號

檢測范圍檢測范圍：：0.62 ng /ml -20 ng /ml

檢測范圍檢測范圍：：

zui低檢測限zui低檢測限：：0.31 ng/ml

zui低檢測限zui低檢測限：：

特異性特異性：：本試劑盒可同時檢測天然或重組的BDNF，且與其他相關蛋白基

特異性特異性：：

本無交叉反應。

有效期有效期：6 個月 （2-8℃避光保存）

有效期有效期

預期應用預期應用：：ELISA 法定量測定人血清，血漿及其它相關生物液體中BDNF

預期應用預期應用：：

含量。

說明說明

說明說明

1.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

2.  剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現(xiàn)象，不會對實

    驗結果造成任何影響。

實驗原理實驗原理

實驗原理實驗原理

     本試劑盒采用雙抗體夾心法檢測BDNF 含量。首先用BDNF 抗體包被微

孔板，制備成固相載體，然后加入樣品 （標準品與待測標本）同時加入酶標

記的BDNF  抗體，特異性地形成固相抗體-抗原-酶標記抗體復合物，加底物

顯色后在酶標儀測定吸光值 （OD 值），根據(jù)標準曲線計算出樣品的含量。

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試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

1.  酶聯(lián)板酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                      一塊（96 孔）。

    酶聯(lián)板酶聯(lián)板

2.  標準品標準品（Standard）：                                           5×0.5ml/瓶。

    標準品標準品

 Standard 1       Standard 2     Standard 3      Standard 4      Standard 5

  0.62ng/ml       1.87ng/ml      4.37ng/ml        10ng/ml         20ng/ml

3.  酶結合物酶結合物（（HRP-conjugate）：）                                    1×6ml/瓶。

    酶結合物酶結合物（（                  ））

4.  顯色劑顯色劑A （（Substrate A）：）：                                     1×7ml/瓶。

    顯色劑顯色劑 （（               ）：）：

5.  顯色劑顯色劑B （（Substrate B）：）：                                     1×7ml/瓶。

    顯色劑顯色劑 （（               ）：）：

6.  終止液終止液（（Stop Solution）：）                                      1×7ml/瓶。

    終止液終止液（（                ））

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

1.  標準規(guī)格酶標儀

2.  高速離心機

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.  蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存標本的采集及保存

標本的采集及保存標本的采集及保存

1.  血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于1000 x g 離心20 分

    鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍

    融。

2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8° C

    1000 x g 離心15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復

    凍融。

注：注：以上標本置以上標本置4℃℃保存應小于保存應小于1 周，周，-20℃℃或或-80℃℃均應密封保存均應密封保存，，-20℃℃不應超過不應超過1 個個

注注：：以上標本置以上標本置 ℃℃保存應小于保存應小于 周周，， ℃℃或或 ℃℃均應密封保存均應密封保存，， ℃℃不應超過不應超過 個個

月，月，-80℃℃不應超過不應超過2  個月個月；標本溶血會影響zui后檢測結；標本溶血會影響zui后檢測結果，果，因此溶血標本不宜進行檢因此溶血標本不宜進行檢

月月，， ℃℃不應超過不應超過 個月個月；；標本溶血會影響zui后檢測結標本溶血會影響zui后檢測結果果，，因此溶血標本不宜進行檢因此溶血標本不宜進行檢

測。測。

測測。。

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操作步驟操作步驟

操作步驟操作步驟

1.  將各種試劑至室溫 〔18-25℃〕平衡半小時。

2.  將酶標板取出，設一個空白對照孔、不加任何液體；每個標準點依次各設

    兩孔，每孔加入相應標準品50ul；其余每個檢測孔直接加待測標本50ul。

3.  每孔加入酶結合物50ul （空白對照孔除外），充分混勻，貼上不干膠封片，

    置37℃溫育1 小時。

4.  手工洗板，棄去孔內(nèi)液體。去離子水注滿各孔，靜置10 秒甩干，重復三

    次后拍干；洗板機洗板，選擇洗滌三次程序，洗板后拍干。

5.  每孔加顯色劑A 液50μl，顯色劑B 液50μl，振蕩混勻后，37℃避光顯色

    15 分鐘，每孔加終止液50μl。

6.  用酶標儀讀數(shù)，取波長450nm，先用空白孔調零點，然后測定各孔OD

    值。

數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理

1.  手工作圖：用雙對數(shù)坐標紙，以標準品濃度為橫軸，以對應的0D 值為縱

    軸，畫出平滑曲線或直線，在曲線上按照待測血清OD 值找到對應的濃度

    值。

2.  計算機：使用線性擬合功能，應將標準品S1-S5  的濃度取對數(shù)（Log（濃

    度））作為X，將對應的OD 值減去空白對照孔OD 值后取對數(shù)（Log（OD

    值-NSB））作為Y，進行線性擬合。再從擬合線上計算出待測血清濃度。

注意事項注意事項

注意事項注意事項

1.  從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及所需預包被板條應置室溫

 （18-25℃）平衡30 分鐘后方可使用，余者應及時封好口，放回2-8℃中避

光保存，以備后用。

2.  使用前試劑應搖勻。

3.  結果判斷須在反應終止后10 分鐘內(nèi)完成。

4.  不同批號的試劑不可混用。

5.  加樣時應注意避免所用各試劑及樣品之間的交又污染。

6.  操作時，試劑盒內(nèi)每種試劑各使用一個吸頭，每一種標準品使用一個吸頭，

    每一個樣品各使用一個吸頭，吸頭一次性使用。

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Notes：：

                 ：：

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