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Mouse Insulin （INS）ELISA Kit
 
 
 
Catalog No. CSB-E05071m
（96T）
 
 
 
 
 
 
  This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of mouse INS
concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
 
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INTRODUCTION
Insulin is a peptide hormone composed of 51 amino acid residues and has a
molecular weight of 5808 Da. It is produced in the islets of Langerhans in the
pancreas. Insulin's structure varies slightly between species of animal. Insulin
has extensive effects on both metabolism and several other body systems （eg,
vascular  compliance）.  Insulin  causes  most  of  the  body's  cells  to  take  up
glucose from the blood （including liver, muscle, and fat tissue cells）, storing it
as glycogen in the liver and muscle, and stops use of fat as an energy source.
When insulin is absent （or low）, glucose is not taken up by most body cells and
the  body  begins  to  use  fat  as  an  energy  source  （ie,  transfer  of  lipids  from
adipose tissue to the liver for mobilization as an energy source）. As its level is
a  central metabolic  control mechanism,  its  status  is  also  used  as  a  control
signal to other body systems （such as amino acid uptake by body cells）. It has
several other anabolic effects throughout the body.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The microtiter plate provided in this kit has been pre-coated with an antibody
specific  to  INS.  Standards  or  samples  are  then  added  to  the  appropriate
microtiter  plate  wells  with  a  Horseradish  Peroxidase  （HRP）-conjugated 
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monoclonal  antibody  preparation  specific  for  INS  and  incubated.  Then
substrate  solution  A  and  B  are  added  to  each  well.  Only  those  wells  that
contain  INS,  HRP-conjugated  antibody  will  exhibit  a  change  in  color.  The
enzyme-substrate  reaction  is  terminated  by  the  addition  of  a  sulphuric  acid
solution  and  the  color  change  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of INS in the samples is then
determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
8µIU/ml-140µIU/ml. The standard curve concentrations used  for  the ELISA’s
were 140µIU/ml,80µIU/ml,32µIU/ml, 16µIU/ml, 8µIU/ml
SPECIFICITY
This  assay  recognizes  recombinant  and  natural mouse  INS.  No  significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum detectable dose of mouse INS is typically less than 5µIU/ml.
The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined as
the lowest concentration that could be differentiated from zero. 
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MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard（S1-S5）  5
HRP-conjugate    1 x 6 ml
Wash Buffer      
1 x 15 ml
  （20×concentrate）
Substrate A  1 x 7 ml
Substrate B  1 x 7 ml
Stop Solution      1 x 7 ml
Standard
Standard
1
Standard
2
Standard
3
Standard
4
Standard
5
Concentration
（µIU/ml）
8  16  32  80  140
STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter  plate  should  be  kept  in  a  sealed  bag  to minimize  exposure  to
damp air. The test kit may be used throughout the expiration date of the kit.
Refer to the package label for the expiration date.
2.  Opened test kits will remain stable until the expiring date shown, provided it
is stored as prescribed above.     
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3.  A microtiter plate reader with a bandwidth of 10 nm or less and an optical
density range of 0-3 OD or greater at 450nm wavelength is acceptable for
use in absorbance measurement.
REAGENT PREPARATION
1.  Bring all  reagents and plate  to  room  temperature  for at  least 30 minutes
before use. Unused wells need store at 2-8°C and av oid sunlight.
2.  Wash Buffer  If  crystals  have  formed  in  the  concentrate, warm  to  room
temperature and mix gently until  the  crystals have  compley dissolved.
Dilute 15 ml of Wash Buffer Concentrate into deionized or distilled water to
prepare 300 ml of Wash Buffer.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear eye,
hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader capable of measuring absorbance at 450 nm, with  the
correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer. 
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SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Serum    Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot for
30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 g. Remove serum
and  assay  immediay  or  aliquot  and  store  samples  at  -20°  C.  Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect  plasma  using  citrate,  EDTA,  or  heparin  as  an
anticoagulant. Centrifuge  for 15 minutes at 1000 g within 30 minutes of
collection. Assay immediay or aliquot and store samples at -20°C. Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is recommended
that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Set a Blank well without any solution. Add 50µl of Standard or Sample per
well. Standard need test in duplicate.  
2.  Reconstitute the every Standard with 0.5 ml of distilled water.
3.  Add 50µl of HRP-conjugate to each well （not to Blank well）. Mix well and
then incubate for 2 hour at 37°C.   
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4.  Complete remove  the liquid. Then fill each well with Wash Buffer （about
200µl）, stay for 10 seconds and Spinning. Repeat the process for a total of
three washes. Complete removal of liquid at each step is essential to good
performance. After  the  last wash, remove any remaining Wash Buffer by
aspirating  or  decanting.  Invert  the  plate  and  blot  it  against  clean  paper
towels.
5.  Add 50µl of Substrate A and 50µl of Substrate B to each well, mix well.
Incubate for 15 minutes at 37°C. Keeping the plate  away from drafts and
other temperature fluctuations in the dark.
6.  Add 50µl of Stop Solution to each well. If color change does not appear
uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
7.  Determine  the  optical  density  of  each  well  within  10  minutes,  using  a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Average  the  duplicate  readings  for  each  standard,  control,  and  sample  and
subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve by
reducing  the  data  using  computer  software  capable  of  generating  a  four
parameter  logistic  （4-PL）  curve-fit.  As  an  alternative,  construct  a  standard
curve by plotting the mean absorbance for each standard on the y-axis against 
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the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the points on
the  graph.  The  data  may  be  linearized  by  plotting  the  log  of  the  INS
concentrations  versus  the  log  of  the  O.D.  and  the  best  fit  line  can  be
determined by regression analysis. This procedure will produce an adequate
but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the concentration
read from the standard curve must be multiplied by the dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve be
consistent with the samples being assayed.
  If  samples  generate  values  higher  than  the  highest  standard,  dilute  the
samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any variation  in Standard Diluent, operator, pipetting  technique, washing
technique, incubation time or temperature, and kit age can cause variation
in binding.
  This  assay  is  designed  to  eliminate  interference  by  soluble  receptors,
binding proteins, and other factors present  in biological samples. Until all
factors have been tested in the Quantikine Immunoassay, the possibility of
interference cannot be excluded. 
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TECHNICAL HINTS
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.
  To  avoid  cross-contamination,  change  pipette  tips  between  additions  of
each  standard  level,  between  sample  additions,  and  between  reagent
additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
  When using an automated plate washer, adding a 30 second soak period
following the addition of wash buffer, and/or rotating the plate 180 degrees
between wash steps may improve assay precision.
  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during
incubation steps is necessary.
  Substrate Solution should remain colorless until added to the plate. Keep
Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should change
from colorless to gradations of blue.
  Stop  Solution  should  be  added  to  the  plate  in  the  same  order  as  the
Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue to
yellow  upon addition of  the Stop Solution. Wells  that are  green  in  color
indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the Substrate
Solution.
 
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小 小小 小鼠 鼠鼠 鼠胰島素 胰島素 胰島素 胰島素（ （（ （Insulin） ）） ）ELISA快速檢測試劑盒 快速檢測試劑盒 快速檢測試劑盒 快速檢測試劑盒
使用說明書 使用說明書 使用說明書 使用說明書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號：CSB-E05071m
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：8µIU /ml -140µIU /ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的 INS，且與其他相關(guān)蛋白基本無
交叉反應(yīng)。
有效期 有效期 有效期 有效期：6 個月（2-8℃避光保存）
預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用： ：： ：ELISA法定量測定小鼠血清，血漿及其它相關(guān)生物液體中 INS 含
量。
說明 說明 說明 說明  
1.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。  
2.  剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)
結(jié)果造成任何影響。
實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理
采用酶聯(lián)免疫法夾心法檢測胰島素含量。首先用一株單抗體包被微孔板，
制備成固相抗體，然后加入待測標(biāo)本及辣根過氧化物酶標(biāo)記的另一株單抗，使
之形成包被抗體-胰島素-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物。經(jīng)顯色后在酶標(biāo)儀測定吸光值
（OD值），通過計(jì)算機(jī)或作圖擬合濃度-吸光度曲線，反算出待測標(biāo)本中胰島素
含量。 
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試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                                                    一塊 （96孔）。   
2.  標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 （Standard）：                                                                       5 瓶（凍干品）。 
Standard 1  Standard 2  Standard 3  Standard 4  Standard 5
8µIU/ml  16µIU/ml  32µIU/ml  80µIU/ml  140µIU/ml
3.  酶結(jié)合物 酶結(jié)合物 酶結(jié)合物 酶結(jié)合物（ （（ （HRP-conjugate） ）） ）：                                                            1×6ml/瓶。 
4.  顯色劑 顯色劑 顯色劑 顯色劑 A（ （（ （Substrate A）： ）： ）： ）：                                                                  1×7ml/瓶。 
5.  顯色劑 顯色劑 顯色劑 顯色劑 B（ （（ （Substrate B）： ）： ）： ）：                                                                  1×7ml/瓶。 
6.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）：       1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 20 倍。   
7.  終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                                  1×7ml/瓶
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.  高速離心機(jī)
3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的 標(biāo)本的 標(biāo)本的 標(biāo)本的采集及保存 采集及保存 采集及保存 采集及保存
1.  血清：全血標(biāo)本請于室溫放置 2 小時或 4℃過夜后于 1000 x g離心 20 分鐘，
取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000
x g離心 15 分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心 20 分鐘，取上清即可檢測，
或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注 注注 注： ：： ：以上標(biāo)本置 以上標(biāo)本置 以上標(biāo)本置 以上標(biāo)本置 4℃ ℃℃ ℃保存應(yīng)小于 保存應(yīng)小于 保存應(yīng)小于 保存應(yīng)小于 1 周 周周 周， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃或 或或 或-80℃ ℃℃ ℃均應(yīng)密 均應(yīng)密 均應(yīng)密 均應(yīng)密封保存 封保存 封保存 封保存， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃不應(yīng)超過 不應(yīng)超過 不應(yīng)超過 不應(yīng)超過 1 個月 個月 個月 個月， ，， ，
-80℃ ℃℃ ℃不應(yīng)超過 不應(yīng)超過 不應(yīng)超過 不應(yīng)超過 2 個月 個月 個月 個月； ；； ；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果， ，， ，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。 。。 。 
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操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
1.  將各種試劑至室溫〔18-25℃〕平衡半小時，取濃縮洗滌液，根據(jù)當(dāng)批檢測
數(shù)量，用蒸餾水上 1：20 稀釋，混勻后備用。
2.  標(biāo)準(zhǔn)品 S1- S 5，*次使用前先用 0.5ml蒸餾水溶解，放置混勻后使用。
3.  將酶標(biāo)板取出，設(shè)一個空白對照孔、不加任何液體；每個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)依次各設(shè)兩
孔，每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品 50ul；其余每個檢測孔直接加待測標(biāo)本 50ul。  
4.  每孔加入酶結(jié)合物 50ul（空白對照孔除外），充分混勻，貼上不干膠封片，
置 37℃溫育 2 小時。
5.  手工洗板，棄去孔內(nèi)液體。洗滌液注滿各孔，靜置 10 秒甩干，重復(fù)三次后
拍干；洗板機(jī)洗板，選擇洗滌三次程序，洗板后拍干。
6.  每孔加顯色劑 A 液 50µl，顯色劑 B 液 50µl，振蕩混勻后，37℃避光顯色 15
分鐘，每孔加終止液 50µl。
7.  用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長 450nm，先用空白孔調(diào)零點(diǎn)，然后測定各孔 OD值。 
數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理
1.  手工作圖：用雙對數(shù)坐標(biāo)紙，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫軸，以對應(yīng)的 0D值為縱軸，
畫出平滑曲線或直線，在曲線上按照待測血清 OD值找到對應(yīng)的濃度值。
2.  計(jì)算機(jī)：使用線性擬合功能，應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)品 S1-S5 的濃度取對數(shù)（Log（濃度））
作為X，將對應(yīng)的OD值減去空白對照孔OD值后取對數(shù) （Log（OD值-NSB））
作為 Y，進(jìn)行線性擬合。再從擬合線上計(jì)算出待測血清濃度。
注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng)
1.  從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及所需預(yù)包被板條應(yīng)置室溫
（18-25℃）平衡 30 分鐘后方可使用，余者應(yīng)及時封好口，放回 2-8℃中避光保
存，以備后用。
2.  使用前試劑應(yīng)搖勻。
3.  結(jié)果判斷須在反應(yīng)終止后 10 分鐘內(nèi)完成。
4.  不同批號的試劑不可混用。
5.  加樣時應(yīng)注意避免所用各試劑及樣品之間的交又污染。
6.  操作時，試劑盒內(nèi)每種試劑各使用一個吸頭，每一種標(biāo)準(zhǔn)品使用一個吸頭，
每一個樣品各使用一個吸頭，吸頭一次性使用。        
 

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