酵母質(zhì)粒提取可以用試劑盒提取，也可以直接用裂壁酶處理后采用堿裂解法提取質(zhì)粒。推薦使用索萊寶供應(yīng)的酵母質(zhì)粒提取試劑盒，無(wú)需使用酚、CCL4等有毒試劑，操作安全。下面我們就用索萊寶酵母質(zhì)粒提取試劑盒為例講解酵母質(zhì)粒提取方法和步驟。
1. 接種單菌落(待檢測(cè)酵母細(xì)胞)于25mLYNB(補(bǔ)加氨基酸 營(yíng)養(yǎng)物)培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)隔夜。
2.第二天取一滴菌液于進(jìn)行顯微鏡下觀察,目鏡用16,物鏡用40倍觀察細(xì)胞壁破碎前的狀態(tài),其成桿狀,流動(dòng)性比較下.
3.取10ml的培養(yǎng)酵母菌液,5000g離心3min,棄上清液.加入5ml的1倍TE懸浮.
4.將懸浮液倒入高壓破壁儀的樣品管中,利用高壓破碎機(jī)進(jìn)行破碎細(xì)胞壁,壓力加到20Mpa,停留15s,降壓,反復(fù)來(lái)回壓3次.取出細(xì)胞液,取一滴于顯微鏡下觀察,如果細(xì)胞呈不規(guī)則的球狀時(shí),而且其流動(dòng)性 比較大,說(shuō)明其細(xì)胞壁已經(jīng)破碎成為原生質(zhì)體.
5.取2個(gè)EP管,每管加入1.5ml上述的細(xì)胞液,12000g離心5min,收集原生質(zhì)體.棄取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混勻冰浴5min,進(jìn)行破原生質(zhì)體.
6.然后加入150ul的tris飽和酚,和150ul的鹵仿異戊醇混合液(鹵仿:異戊醇=24:1),混勻,12000g,離心10min.
7.將水相移到另一EP管中,加入等體積的鹵仿異戊醇混合液(鹵仿:異戊醇=24:1), 混勻,12000g,離心10min.
8. 將水相移到另一EP管中,加入1/10體積的3M KAC溶液和2倍體積的無(wú)水乙醇,放入-20℃冰箱中
9.1h,12000g離心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的無(wú)水乙醇,混勻,12000g,離心10min.
10.棄去乙醇,等室溫干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去處RNA酶,加入1ul的100mg/ml濃度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可.
11.跑電泳進(jìn)行檢測(cè)是否從酵母菌中提出質(zhì)粒了。
以上是用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取方法和步驟，如果還有不理解地方可以索萊寶.索萊寶為您提供真誠(chéng)技術(shù)服務(wù)。
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