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一氧化氮（NO）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)（化學(xué)法）

可見(jiàn)分光光度法

貨號(hào)：BC5480

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入15mL蒸餾水，可50℃助溶，2-8 ℃可保存12周。冷卻至常溫使用；

2、 顯色液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照顯色液A液：顯色液B液=250μL: 250μL（500μL，1T）的比例配制顯色液，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL亞*酸鈉。

4、 0.025μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取50μL 10μmol/mL亞*酸鈉，加入950μL蒸餾水，配制濃度為0.5 μmol/mL；再取50μL 0.5μmol/mL亞*酸鈉和950μL蒸餾水混勻配制成0.025 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，分子小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，常溫下為氣體，微溶于水，具有脂溶性，可快速透過(guò)生物膜擴(kuò)散，作為一種新型的生物信使分子，在細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮傳遞信號(hào)的作用。其廣泛分布于生物體內(nèi)各組織中，特別是神經(jīng)組織中。在機(jī)體神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中也起著十分重要的作用。

NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO₂^-。在酸性條件下，NO₂^-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值，可以計(jì)算NO含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、分析天平、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：按質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）2 ~5：10的比例加入提取液（建議稱(chēng)取0.2g樣本，加入1.0mL提取液），冰浴勻漿后，于4℃，10000g，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁴）：提取液體積（mL）1000~2000 : 1的比例加入提取液（建議1000萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞加入1.0mL提取液），冰浴超聲破碎細(xì)菌/細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間5min），然后于4℃，10000g，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測(cè)。

3. 血清（血漿）等液體樣本：直接測(cè)定。若液體有渾濁則離心取上清測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1．可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm，蒸餾水調(diào)零。

2．在1.5mL EP管按下表順序加樣：

三、NO含量計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

NO含量（μmol/mg prot）= ΔA測(cè)定×（C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷(V樣×Cpr) = 0.025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

NO含量（μmol/g 質(zhì)量）= ΔA測(cè)定×（C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷(W×V樣÷V樣總) = 0.025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

3. 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

NO含量（μmol/10⁴ cell）=ΔA測(cè)定×（C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷(V樣×N÷V樣總) = 0.025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

4. 按液體體積計(jì)算

NO含量（μmol/mL）= ΔA測(cè)定×（C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷V樣= 0.025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.025μmol/mL；V樣：加入樣本體積，0.5mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌/細(xì)胞總數(shù)，以10⁴計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1、 如果?A測(cè)定小于0.005，可以增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定；如果?A測(cè)定大于0.5，建議將樣本上清用提取液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

2、 如果樣本上清有顏色（在550nm下有吸收峰），則需要補(bǔ)測(cè)樣本的對(duì)照管，即將顯色液用相同體積的蒸餾水代替。在550 nm下測(cè)定吸光值A，分別記為 A標(biāo)準(zhǔn)、A測(cè)定、A空白、A對(duì)照，計(jì)算ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白，ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照。此時(shí)試劑盒規(guī)格為50T/24S。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.203g合歡葉片樣本，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.046-0.000=0.046，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.290-0.000=0.290，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

NO含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W = 0.0195 μmol/g 質(zhì)量。

2. 取0.215g小鼠心臟樣本，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.082-0.000=0.082，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.290-0.000=0.290，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

NO含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W = 0.0329 μmol/g 質(zhì)量。

3. 取500μL人血清樣本，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.028-0.000= 0.028，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.290-0.000=0.290，按液體體積計(jì)算得：

NO含量（μmol/mL）=0.025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn) = 0.0024 μmol/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] Green LC, Wagner DA, Glogowski J. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids[J]. Analytical Biochemistry, 1982, 126(1): 131-138.

[2] Thomsen LL, Ching LM, Baguley BC. Evidence for the production of nitric oxide by activated macrophages treated with the antitumor agents flavone-8-acetic acid and xanthenone-4-acetic acid [J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 1990, 50(21): 6966-6970. 

[3] Yang Wenping, Li Junmin, Wang Jinwen. Comparison of determination methods of serum nitric oxide content[J]. Experimental and Laboratory Medicine, 2002, 20(03): 147-148. 

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