1.用HPLC進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移,有時發(fā)生快速變化,原因何在?如何解決?

關(guān)于漂移問題

①溫度控制不好,解決方法是采用恒溫裝置,保持柱溫恒定

②流動相發(fā)生変化,解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等

③柱子未平衡好,需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡

關(guān)于快速變化問題

①流速發(fā)生變化,解決辦法是重新設(shè)定流速,使之保持穩(wěn)定

②泵中有氣泡,可通過排氣等操作將氣泡趕出。

③流動相不合適,解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合

2.為何會基線漂移

原因

①柱溫波動。(即使是很小的溫度變化都會引起基線波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。)

②流動相不均勻。(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。)

③流通池被污染或有氣體

④檢測器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂,產(chǎn)生噪音基線)

⑤流動相配比不當(dāng)或流速變化

⑥柱平衡慢,特別是流動相發(fā)生變化時

⑦流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

⑧樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高K值)以頭峰樣被洗脫出,從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。

⑨使用循環(huán)溶劑,不提倡。未調(diào)整檢測器。

⑩檢測器沒有設(shè)定在zui大吸收波長處。

解決方法

①控制好柱子和流動相的溫度,在檢測器之前使用熱交換器。

②使用HPLC級的溶劑,高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進(jìn)行脫氣,使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。

③用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑中洗流通池。如有需要,可以用1N的的酸,(不要用鹽酸）。

④取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。

⑤更改配比或流速。為避兔這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

⑥用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗。更改流動相時,在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進(jìn)行沖洗。使用離子對試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱。

⑦檢查流動相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑。

⑧改變分析條件。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過程中,定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。

⑨重新設(shè)定基線。使用新的流動相。

⑩將波長調(diào)整至zui大吸收波長處。重選檢測波長。

3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

①樣品量不足,解決方法為増加樣品量。

②樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子。

③樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢器

④檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。

⑤檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù)。

⑥檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。

⑦檢池中有氣泡。解決辦法為排氣。

4. 如何進(jìn)行色譜柱的維護(hù)？

①建議檢測前樣品和流動相進(jìn)行過濾。

②建議每天做完樣品后及時進(jìn)行清洗。

③常規(guī)檢測：測試完后直接把色譜柱反向連接采用90%有機(jī)相沖洗45min，zui后保存在純甲醇或純乙腈中。

④使用緩沖鹽條件：

a.等度條件：使用緩沖鹽之前和之后都用過渡流動相以1ml/min流速沖洗45min

b.梯度條件：使用緩沖鹽之前與初始流動相組成相同的過渡流動相以1ml/min流速沖洗45min。

注意：過渡流動相是指有機(jī)相和水相比例與分析流動相相同比例，只是不含有緩沖鹽。

c.緩沖鹽沖洗干凈后，采用90%有機(jī)相反向沖洗60min，zui后保存在純有機(jī)溶劑中。

注意：如果使用緩沖液不能存留色譜柱中過夜。

5.規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

原因

①在流動相、檢測器或泵中有空氣(尖銳峰)。

②漏液。

③流動相混合不*。

④溫度影響(柱溫過高,檢測器未加熱)。

⑤在同一條線上有其他電子設(shè)備(偶然噪聲）

⑥泵振動

解決方法

①流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。

②檢查管路接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換泵密封。

③用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑。

④減少差異或加上熱交換器。

⑤斷開LC、檢測器和記錄儀,檢查干擾是否來自于外部,加以更正。采用精密級穩(wěn)壓電源。

⑥在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。

6.不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

原因

①漏液。

②流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成。

③流動相各溶劑不相溶

④檢測器/記錄儀電子元件的問題

⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡

⑥檢測器內(nèi)有氣泡

⑦流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。

⑧檢測器燈能量不足

⑨色譜柱填料流失或阻塞

⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常

解決方法

①檢查接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封。檢查流通池是否漏液。

②檢査流動相的組成。

③選擇互溶的流動相

④斷開檢測器和記錄儀的電源,檢查并更正。

⑤用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)

⑥清洗檢測器,在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器

⑦用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

⑧更換燈

⑨更換色譜柱

維修或更換混合器,在流動相不走梯度時,建議不使用泵的混合裝置

7.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時，很傷柱子，如使用一段時間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)？

答：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨)，之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1％。

8.液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？

①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。
②存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子。
③可能柱超載，減少進(jìn)樣量。

9.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法是什么？

①樣品量不足，解決辦法為增加樣品量。
②樣品未從柱子中流出，可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子。
③樣品與檢測器不匹配，根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器。
④檢測器衰減太多，調(diào)整衰減即可。
⑤檢測器時間常數(shù)太大，解決辦法為降低時間參數(shù)。
⑥檢測器池窗污染，解決辦法為清洗池窗。
⑦檢測池中有氣泡，解決辦法為排氣。
⑧記錄儀測壓范圍不當(dāng)，調(diào)整電壓范圍即可。
⑨流動相流量不合適，調(diào)整流速即可。
⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線，解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

10.做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？

①泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理。
②比例閥失效，更換比例閥即可。
③泵密封墊損壞，更換密封墊即可。
④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法。
⑤系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可。
⑥梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

11.HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么？

柱壓過高是HPLC柱用戶zui常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因：
①拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查。
②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查。
③將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查。只用于使用過的柱子。
④更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。

12.為何出現(xiàn)峰展寬？

①樣品體積過大：用流動相配樣，總的樣品體積小于峰的15%。
②在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展:進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散。
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢:設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點。
④流動相粘度過高:增加柱溫，采用低粘度流動相。
⑤檢測池體積過大:用小體積池，卸下熱交換器。
⑥保留時間過長:等度洗脫時增加強(qiáng)溶劑含量，也可用梯度洗脫。
⑦柱外體積過大:將連接管徑和連接管長度降至zui小。
⑧樣品過載:進(jìn)小濃度小體積樣品。

13.流動相出現(xiàn)氣泡的原因有哪些？

①流動相溶液中往往因溶解有氧氣或空氣而形成氣泡。
②液路阻力比較大，吸液時出現(xiàn)了真空氣泡。
③系統(tǒng)開始工作時未能將流路中的空氣排除干凈。
④在注入樣品時混入了空氣。

14.常用的實驗室脫氣方式還有哪些？

①加熱回流脫氣，脫氣效果*，但無法保持。

②氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多。

③真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失。

④超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中zui常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。

15.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時，很傷柱子，如使用一段時間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)？

答：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨)，之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1％。