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            上海研謹(jǐn)生物科技有限公司

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            基因克?。ǐ@得目的基因的方法)

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            廠商性質(zhì)生產(chǎn)商

            所在地上海市

            更新時(shí)間:2025-02-18 10:27:40瀏覽次數(shù):1503次

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            產(chǎn)地類別 國(guó)產(chǎn) 應(yīng)用領(lǐng)域 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè)
            提供商: 上海研謹(jǐn)生物
            服務(wù)名稱: 基因克隆服務(wù)
            規(guī)格: 實(shí)驗(yàn)服務(wù)
            價(jià)格: 2000元
            收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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            基因克隆

             

             

             

            一.目的基因的獲得

            目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因,也就是將要克隆或表達(dá)的基因。獲得目的基因是分子克隆過(guò)程中重要的一步。目前用于獲得目的基因的方法有幾種,如限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫(kù)篩選法、體外擴(kuò)增法和人工合成法等,其中限制性內(nèi)切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 或逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 體外擴(kuò)增目的DNA--片段是目前常用的方法。

             

            ()采用限制性酶切法直接分離目的基因

            1、從原核基因組中制備原核基因組相對(duì)較小,用幾種限制性內(nèi)切酶分別消化原核基因組,或用某種限制性內(nèi)切酶對(duì)所要研究的基因組進(jìn)行部分消化,可以得到大小不等的各種片段,其中有些片段就會(huì)含有目的基因,將這些片段插入載體中進(jìn)行克隆,經(jīng)過(guò)篩選,可以得到所需的目的基因。

            2.從真核基因組中制備真核基因組比較大,直接用限制性內(nèi)切酶消化后需要篩選的克隆數(shù)太多,不易操作。可以用一種限制性內(nèi)切酶先消化基因組DNA,產(chǎn)生連續(xù)的DNA--片段,然后電泳分離這些DNA--片段,再用-段特異探針與這些DNA--片段進(jìn)行雜交,在含有特異性模板的區(qū)域就會(huì)出現(xiàn)雜交帶,可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們也可以將酶切后的基因組DNA--片段全部克隆入適當(dāng)?shù)妮d體中,制成基因組文庫(kù),再用特異性探針與基因組文庫(kù)中的不同克隆進(jìn)行雜交,陽(yáng)性克隆即示克隆到的DNA--片段含有特異基因序列。將陽(yáng)性克隆測(cè)序,用第--個(gè)克隆片段的末端分離下一個(gè)克隆片段,然后利用DNA--片段間的重疊順序來(lái)鑒定其他克隆。這樣一步步走下去,終可得全部基因序列,這種技術(shù)叫做染色體步移(chromosome walking)。

             

            (二)采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因

            1.根據(jù)已發(fā)表的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物,采用PCR (以基因組DNA為模板)或RT-PCR (以mRNA為模板)從組織或細(xì)胞中獲取目的基因片段用于基因操作,這是實(shí)驗(yàn)室中常用的獲取已知基因的方法。

            2.利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點(diǎn)就是可以根據(jù)需要在引物序列上設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)起始密碼子或終止密碼子等,或通過(guò)人為錯(cuò)配改變堿基序列(人工突變)對(duì)目的基因進(jìn)行有限修飾。對(duì)于未知基因,可采取構(gòu)建RT-PCR文庫(kù)的方法獲得未知基因:利用mRNA末端poly A序列尾設(shè)計(jì)共用引物,將所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用各種工具酶在cDNA末端加尾,然后采用一對(duì)共用引物擴(kuò)增所有cDNA--片段,將經(jīng)PCR擴(kuò)增后的片段插入到適當(dāng)載體中,構(gòu)建成PCR-CDNA文庫(kù)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以將表達(dá)水平很低的mRNA擴(kuò)增出來(lái),有利于篩選出表達(dá)豐度低的基因。由于經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增,基因序列的精que確性需要采用其他方法進(jìn)一步確定。

            3.還有一個(gè)獲得目的基因的方法是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)克隆。即利用GenBank中的基因信息,通過(guò)軟件比較不同種屬基因之間的相似性(同源性),利用保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物, 再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細(xì)胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實(shí)現(xiàn)的一種獲得新基因的捷徑。

            (三)基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

            1.將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化后插入到適當(dāng)載體中,得到含有不同插入片段的克隆載體,這種克隆載體的混合物含有長(zhǎng)短不同的基因組片段,這就是基因文庫(kù)。若將細(xì)胞內(nèi)所有mRNA均逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后將所有cDNA--片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中,構(gòu)建成含有不同cDNA--片段的克隆載體混合物,這就是cDNA文庫(kù)。目前許多組織或細(xì)胞的基因組或cDNA文庫(kù)都可以從商業(yè)公司買到。

            2.當(dāng)獲得了基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù),可以根據(jù)已知的信息合成特異性探針,采用核酸分子雜交的方法從文庫(kù)中篩選感興趣的基因片段,這仍是目前獲得新基因的一種常用手段?;蚪M文庫(kù)或cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和使用請(qǐng)參見(jiàn)本書相應(yīng)的章節(jié)。

             

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            實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

             

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            免疫共沉淀(CHIRP)實(shí)驗(yàn)

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            酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)

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            染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

             

            多因子液相芯片技術(shù)(Luminex)實(shí)驗(yàn)

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            (Label-free)

             

            DIGE技術(shù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

            端粒酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

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            實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

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