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聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)問(wèn)題解析
閱讀：61 發(fā)布時(shí)間：2025-2-18聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+存在的條件下，依賴(lài)于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個(gè)引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性→退火→延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過(guò)量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸。理論上，經(jīng)過(guò)N次循環(huán)可使特定片段擴(kuò)增到2n-1，考慮到擴(kuò)增效率達(dá)不到100%，所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴(kuò)增到106倍，足夠后續(xù)實(shí)驗(yàn)展開(kāi)。
常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：
1、 無(wú)擴(kuò)增條帶
1)、 酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過(guò)更換新酶或用另一來(lái)源的酶以獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。
2)、模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。
3)、 變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過(guò)高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過(guò)低則模板變性不徹di。
4)、反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。
5)、 引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。
6)、 引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
7)、 DNA凝膠電泳時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問(wèn)題。
2、PCR產(chǎn)物量過(guò)少
1)、退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
2)、 DNA模板量太少。增加DNA模板量。
3)、 PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。
4)、 引物量不足。增加體系中引物含量。
5)、延伸時(shí)間太短。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時(shí)間。
6)、 變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。
3、擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
1)、酶量過(guò)高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來(lái)源的酶。
2)、dNTP濃度過(guò)高。減少dNTP的濃度。
3)、 MgCl2濃度過(guò)高。可適當(dāng)降低其用量。
4)、 模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng。
5)、 引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。
6)、 循環(huán)次數(shù)過(guò)多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
7)、 退火溫度過(guò)低。
8)、 電泳體系有問(wèn)題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒(méi)有凝固好；
③瓊脂糖質(zhì)量差。
9）、若為PCR試劑盒則可能：
① 由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；
② 試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。
10）、降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。
4、擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)
1)、 引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。
2)、 循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。
3) 、酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。
4)、退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
5)、樣品處理不當(dāng)。
6)、 Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。
7)、若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。
8)、 復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。
9)、 反應(yīng)緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化全并徹di混勻。
10)、 引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
11)、 引物量過(guò)多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。
12)、 模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
13)、外源DNA污染。確保操作的潔凈。
5、 陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶
試劑，槍頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。
6.、條帶大小與理論不符
1) 、污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。
2) 、模板或引物使用錯(cuò)誤。更換引物和模板。
3) 、基因亞型。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。