白介素8受體(可溶性)ELISA KIT
白介素8受體(可溶性)ELISA KIT介紹
白介素 8(IL-8),又稱(chēng)趨化因子 CXCL8,是一種由單核 - 巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子,分子量約 8kd。多種細(xì)胞在 LPS、TNF 或 IL-1 刺激下均可產(chǎn)生 IL-8 。IL-8 通過(guò)結(jié)合趨化因子受體白細(xì)胞介素 - 8 受體 α(IL8-Rα,CXCR1)和白細(xì)胞介素 - 8 受體 β(IL-8Rβ,CXCR2),對(duì)中性粒細(xì)胞發(fā)揮趨化和激活作用,參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng) 。在自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病等病癥中,IL-8 產(chǎn)生異常,因此定量檢測(cè) IL-8 對(duì)于研究疾病發(fā)生發(fā)展及指導(dǎo)治療意義重大 。而白介素 8 受體(可溶性)ELISA KIT 正是用于精準(zhǔn)檢測(cè)相關(guān)樣本中可溶性白介素 8 受體含量的工具 。
一、檢測(cè)原理
二、試劑盒組成
酶聯(lián)板:已預(yù)包被抗人白介素 8 受體(可溶性)抗體,一般為 96 孔或 48 孔,用于承載樣本和試劑反應(yīng) 。
標(biāo)準(zhǔn)品:通常為凍干品,有 2 瓶 。臨用前需用樣品稀釋液溶解并稀釋至特定濃度(如高濃度標(biāo)準(zhǔn)品可能為 1600pg/mL),再進(jìn)行系列倍比稀釋?zhuān)玫讲煌瑵舛忍荻鹊臉?biāo)準(zhǔn)品溶液,如 800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL 等,用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。
樣品稀釋液:用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及稀釋濃度過(guò)高的待測(cè)樣本,一般為 1×20mL 裝 。
生wu素標(biāo)記抗體:與可溶性白介素 8 受體特異性結(jié)合,為濃縮液,使用時(shí)需用生wu素標(biāo)記抗體稀釋液按比例稀釋?zhuān)话銥?1×120μL / 瓶(1:100) 。
生wu素標(biāo)記抗體稀釋液:1×10mL 裝,用于稀釋生wu素標(biāo)記抗體 。
HRP 偶聯(lián)的親和素:與生wu素標(biāo)記抗體結(jié)合,形成完整的檢測(cè)體系,為濃縮液,使用時(shí)需用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液按比例稀釋?zhuān)话銥?1×120μL / 瓶(1:100) 。
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液:1×10mL 裝,用于稀釋 HRP 偶聯(lián)的親和素 。
底物溶液(TMB):1×10mL 裝,與 HRP 發(fā)生顯色反應(yīng),在 HRP 催化下 TMB 由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色 。
濃洗滌液:1×20mL 裝,使用時(shí)需用蒸餾水或去離子水按一定比例(如 1:25)稀釋?zhuān)糜谙礈烀嘎?lián)板,去除未結(jié)合的物質(zhì),降低背景干擾 。
終止液:1×10mL 裝,一般為 2N 的硫酸溶液,用于終止顯色反應(yīng),使藍(lán)色反應(yīng)液轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 。
覆膜:多為 5 張,用于在溫育過(guò)程中覆蓋酶聯(lián)板,防止液體蒸發(fā)和外界污染 。
使用說(shuō)明書(shū):1 份,詳細(xì)介紹試劑盒的使用方法、注意事項(xiàng)、性能指標(biāo)等 。
三、樣本要求
血清:采集全血后,室溫放置 2 小時(shí)或 4°C 過(guò)夜,隨后以 1000×g 離心 20 分鐘,小心吸取上清液用于檢測(cè) 。收集血液應(yīng)使用一次性無(wú)熱原、無(wú)內(nèi)毒素的試管 。
血漿:可選用乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素作為抗凝劑 。標(biāo)本采集后,需在 30 分鐘內(nèi)于 2 - 8°C 以 1000×g 離心 15 分鐘,取上清備用 。
組織勻漿:先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01M,pH = 7.4)沖洗組織,che底去除殘留血液(因勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)干擾測(cè)量) 。稱(chēng)取適量組織并剪碎,按照約 1:9 的重量體積比(如 1g 組織對(duì)應(yīng) 9mL PBS,可按需調(diào)整并記錄),將剪碎組織與 PBS 加入玻璃勻漿器,在冰上充分研磨 。為進(jìn)一步裂解細(xì)胞,可對(duì)勻漿液超聲破碎或反復(fù)凍融 。最后,將勻漿液以 5000×g 離心 5 - 10 分鐘,取上清用于檢測(cè) 。
細(xì)胞培養(yǎng)上清:將細(xì)胞培養(yǎng)上清以 1000×g 離心 20 分鐘,去除雜質(zhì)及細(xì)胞碎片,取上清即可用于檢測(cè) 。
其他生物標(biāo)本:如腦脊液、腹水等,一般以 1000×g 離心 20 分鐘,取上清進(jìn)行檢測(cè) 。
四、操作流程
準(zhǔn)備工作:從冰箱取出試劑盒,提前 30 分鐘平衡至室溫,確保所有試劑溫度與室溫一致 。同時(shí),將濃縮洗滌液按要求比例用蒸餾水或去離子水稀釋備用 。
加樣:設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔 。空白孔加入 100μL 樣品稀釋液;標(biāo)準(zhǔn)孔分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 100μL;待測(cè)樣品孔加入 100μL 待測(cè)樣本 。加樣時(shí),將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,避免產(chǎn)生氣泡,隨后用覆膜蓋住酶聯(lián)板,37°C 溫育 120 分鐘 。
洗滌:溫育結(jié)束后,棄去孔內(nèi)液體,將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上,輕輕拍干 。每孔加入 350μL 洗滌液,浸泡 1 - 2 分鐘后,甩去洗滌液,再次拍干 。重復(fù)洗滌步驟 5 次,確保che底洗去未結(jié)合的物質(zhì) 。
加生wu素標(biāo)記抗體:每孔加入 100μL 稀釋好的生wu素標(biāo)記抗體工作液(臨用前配制),覆膜后 37°C 溫育 60 分鐘 。
再次洗滌:溫育完成后,按上述洗滌方法再次洗滌酶聯(lián)板 5 次 。
加 HRP 偶聯(lián)的親和素:每孔加入 100μL 稀釋好的 HRP 偶聯(lián)的親和素工作液,覆膜后 37°C 溫育 60 分鐘 。
第三次洗滌:重復(fù)洗滌步驟 5 次 。
顯色:每孔加入 90μL 底物溶液(TMB),輕輕混勻,37°C 避光顯色 。顯色時(shí)間一般控制在 30 分鐘內(nèi),期間需密切觀察標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色變化,當(dāng)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前 3 - 4 孔有明顯的梯度藍(lán)色,后 3 - 4 孔梯度不明顯時(shí),即可進(jìn)行下一步 。
終止反應(yīng):每孔加入 50μL 終止液,輕輕混勻,此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,且底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液 。
讀數(shù):在加終止液后 15 分鐘內(nèi),用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度(OD 值) 。
計(jì)算結(jié)果:以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),OD 值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。可借助專(zhuān)業(yè)的曲線制作軟件(如 Curve Expert 1.3 或 1.4),根據(jù)樣品的 OD 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的濃度,再乘以樣品的稀釋倍數(shù),即為樣品中白介素 8 受體(可溶性)的實(shí)際濃度 。
五、性能指標(biāo)
檢測(cè)范圍:不同試劑盒有所差異,常見(jiàn)檢測(cè)范圍為 15.6pg/mL - 1000pg/mL 等 。
靈敏度:通??傻椭聊軝z測(cè)出 3pg/mL 甚至更低濃度的可溶性白介素 8 受體 。
特異性:試劑盒對(duì)白介素 8 受體(可溶性)具有高度特異性,與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物幾乎無(wú)交叉反應(yīng) 。
重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)(CV)一般小于 10%,板間變異系數(shù)小于 15% 。
準(zhǔn)確性:通過(guò)對(duì)已知濃度的可溶性白介素 8 受體標(biāo)準(zhǔn)品多次檢測(cè),測(cè)量值與理論值的偏差在合理范圍,一般回收率在 80% - 120% 之間 。
六、注意事項(xiàng)
試劑盒從冰箱取出后需平衡至室溫方可使用,使用后應(yīng)立即按要求保存試劑,避免試劑反復(fù)凍融 。
操作過(guò)程中應(yīng)使用一次性吸頭,防止交叉污染 。加樣時(shí),確保吸頭垂直且深入孔底,避免液體掛壁或產(chǎn)生氣泡 。
洗滌是關(guān)鍵步驟,洗滌不充分易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果 。若使用自動(dòng)洗板機(jī),需提前熟練掌握其操作方法,并定期校準(zhǔn) 。
底物溶液對(duì)光敏感,應(yīng)避光保存,使用過(guò)程中避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下 。顯色反應(yīng)需在 37°C 避光條件下進(jìn)行,且嚴(yán)格控制顯色時(shí)間 。
終止液具有腐蝕性,操作時(shí)應(yīng)小心,避免接觸皮膚和眼睛 。若不慎接觸,應(yīng)立即用大量清水沖洗,并及時(shí)就醫(yī) 。
建議所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均做雙份檢測(cè),以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性 。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高,應(yīng)先進(jìn)行稀釋?zhuān)僦匦聹y(cè)定,計(jì)算結(jié)果時(shí)需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù) 。
不同批次的試劑盒內(nèi)試劑不能混用,使用前應(yīng)仔細(xì)核對(duì)試劑盒的有效期和批次號(hào) 。
該試劑盒僅用于科研用途,不得用于臨床診斷 。