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            細(xì)胞技術(shù)專題:小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

            2014-4-17  閱讀(2260)

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            標(biāo)簽: 小鼠 腹腔 巨噬 細(xì)胞培養(yǎng)

            小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培可以:(1)吞噬與清除異物;(2)分泌生物活性物質(zhì);(3)對仿生全降解材料,降解后的無機(jī)產(chǎn)物與生命過程中有機(jī)物的合成作用。

            實(shí)驗(yàn)方法

            • 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
            實(shí)驗(yàn)方法原理取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與乳膠顆粒在不同培養(yǎng)條件下混合后定量加入24孔板,37 ℃,5% CO培養(yǎng)箱中孵育后,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
            實(shí)驗(yàn)材料

            小鼠

            試劑、試劑盒

            1640 培養(yǎng)基 小牛血清 雙抗 臺盼蘭

            儀器、耗材

            手術(shù)器械 一次性注射器 眼科鑷 眼科剪 96 孔板 CO2培養(yǎng)箱

            實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)步驟
             

            1. 如果采用刺激物,則可在實(shí)驗(yàn)前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL,獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)要多一些。不采用刺激物,直接開始下面的步驟。

             

            2. 拉頸處死小鼠,在75%酒精浸泡1-2 分鐘,移入超凈臺中,仰臥位固定于解剖板上,碘酒消毒腹部皮膚,酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開腹部皮膚,暴露腹部肌層,再用酒精綿球消毒腹部肌層。

             

            3. 用注射器抽取5mL 含雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基注入腹腔,用綿球輕揉腹部1-2 min,然后,用眼科鑷稍提起腹腔,并用眼科剪剪開一個小口,用吸管吸取細(xì)胞懸液,移入離心管中(個人認(rèn)為,此法比用注射器抽吸好一些)。

             

            4. 1000 rpm 離心5 min 后,用含雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基洗滌一次,再次離心,重懸細(xì)胞于含10% 小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中,如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用,則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù),將細(xì)胞稀釋到目的濃度后,接種即可。

             

            5. 如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用,調(diào)整濃度至2x105個/mL,接種到96 孔板中,每孔100-200 µL;如 果作為其它實(shí)驗(yàn)使用,可以調(diào)整成2x106/mL,加到 24 孔平底培養(yǎng)板中,1 mL/孔;5% CO2溫箱孵育2 h 后, 換液,并用RPMI 1640 培養(yǎng)基洗1-2 次,棄去未粘附細(xì)胞,貼壁細(xì)胞為單層的巨噬細(xì)胞。

            二、結(jié)果

             

            巨噬細(xì)胞剛貼壁時偏圓形,或者類似鵝卵石形狀,然后慢慢伸出偽足,鋪開呈三角形或多角形。巨噬細(xì)胞有吞噬的特性,當(dāng)與細(xì)菌混合在一起的時候,在40 倍物鏡下可以看到巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌,因此,巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以清除部分污染的細(xì)菌、支原體和部分細(xì)胞碎片。

            收起 
            注意事項(xiàng)

            注意事項(xiàng):嚴(yán)格無菌操作,在超凈臺內(nèi)進(jìn)行;為避免交叉感染,每一只小鼠更換注射器;吸管吸取細(xì)胞懸液的時候,盡量不要吸到大小腸,否則容易引起成纖維細(xì)胞污染。

            展開 
            其他

            一、討論

            巨噬細(xì)胞一般沒有特殊的鑒定方法,有兩條經(jīng)驗(yàn):

            1. 巨噬細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,不會增殖

            2. 很難消化下來,所以接種的時候,必須直接接種到目的培養(yǎng)器皿中。

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