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細(xì)胞染色專題——熒光染料選擇指南
細(xì)胞培養(yǎng)后，需要對其生長情況、形態(tài)甚至生物學(xué)性狀進(jìn)行觀察。由于細(xì)胞小而復(fù)雜，若不借助適當(dāng)?shù)氖侄?，難以觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)，更難發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細(xì)胞的技術(shù)，從光學(xué)顯微鏡到電子顯微鏡，從一般細(xì)胞化學(xué)法到免疫化學(xué)法。細(xì)胞染色是研究細(xì)胞生物學(xué)特征的一種常用手段，然而，對于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)新手來說，想要獲得一張漂亮的細(xì)胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細(xì)胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。今天小愛就為大家整理了幾種常用細(xì)胞染色方法及染色劑選擇指南，快來學(xué)習(xí)！
表1 幾種常用細(xì)胞染色方法及特點(diǎn)
| 染色方法 | 染色特點(diǎn)及應(yīng)用范圍 |
| 革蘭氏染色法 | 一種重要的細(xì)菌鑒別染色法，經(jīng)染色后，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，從而用以分類鑒定。 |
| 瑞氏染色法 | 瑞氏試劑中酸性伊紅和堿性美藍(lán)混合經(jīng)化學(xué)作用后，變成中性的伊紅化美藍(lán)，久置后，經(jīng)氧化而含有天青。此三種染料分別和細(xì)胞中的NH3+和COO-等結(jié)合，使細(xì)胞核及胞漿著色。由于系中性染料，又有緩沖液調(diào)節(jié)酸堿度，所以細(xì)胞受染后，藍(lán)紅等顏色都較適中，核染質(zhì)、胞漿以及其中顆粒顯色較為清楚。 |
| 姬姆薩染色法 | 病理學(xué)以及疾病研究中常用的染色劑。染色原理和結(jié)果與瑞氏染色法基本相同。但該法對細(xì)胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更清晰，而細(xì)胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長，可用復(fù)合染色法。 |
| 免疫組化染色法 | 利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合，用于研究細(xì)胞產(chǎn)物如分子、蛋白質(zhì)或糖蛋白的表達(dá)、定位、分布和遷移等。 |
了解細(xì)胞染色方法后，下面小愛向大家介紹研究不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)用到的熒光染料。
一、細(xì)胞膜常用染料
DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細(xì)胞膜染料（見表2），它們是一族親脂性的熒光染料，用于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)研究。該系列染料進(jìn)入細(xì)胞膜后，會在整個細(xì)胞膜上側(cè)向擴(kuò)散，在最佳濃度時可以使整個細(xì)胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，熒光不易猝滅，無明顯細(xì)胞毒性，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應(yīng)用于多種細(xì)胞的體內(nèi)示蹤研究，如Treg細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、造血干祖細(xì)胞等。
表2 細(xì)胞膜常用染料及熒光顏色
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 熒光顏色 | λEx(nm)/ λEm (nm) |
| abs47048165 | DiD 對氯苯磺酸鹽 | 紅色 | 644/663 |
| abs45153692 | DiR 碘化物 | 深紅色 | 748/780 |
| abs45153674 | DiO 高氯酸鹽 | 綠色 | 484/501 |
| abs42002237 | DiI 高氯酸鹽 | 橙色 | 549/565 |
二、其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)常用染料
生物染料在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組分鑒定中有著廣泛的應(yīng)用，除細(xì)胞膜研究外，我們經(jīng)常也會對一些其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)及成分進(jìn)行探索，例如線粒體、溶酶體、蛋白質(zhì)、細(xì)胞核等，而對于不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有不同的染料進(jìn)行染色，小愛總結(jié)如下：
表3常用細(xì)胞染料及用途
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品用途 |
| abs47047616 | DAPI染色液 | 細(xì)胞和組織細(xì)胞核染色。 |
| abs47048270 | TRITC- Phalloidin | 選擇性結(jié)合絲狀肌動蛋白F-actin，用于細(xì)胞骨架研究。 |
| abs47047622 | 臺盼藍(lán)染色液(0.4%) | 常用于檢測細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞存活率。 |
| abs47047618 | 姬姆薩染液 | 用于染色體、血液、組織切片、原生動物寄生蟲等。 |
| abs47047620 | Hoechst 33342 | 標(biāo)記DNA，也用于細(xì)胞核和線粒體的顯像觀察。 |
| abs47047744 | JC-10 | 可以檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。 |
| abs47014951 | 吖啶橙鹽酸鹽 | 細(xì)胞周期研究，細(xì)胞培養(yǎng)物和組織模型的凋亡研究。也能用作溶酶體染料，但缺乏特異性。 |
| abs42023979 | (+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯 | 在溫和條件下標(biāo)記蛋白質(zhì)、肽、細(xì)胞器、抗體、寡核苷酸和微珠。 |
三、細(xì)胞染色神器DAPI + Phalloidin
DAPI染色液(DAPI Staining Solution)常用于細(xì)胞核染色，可將細(xì)胞核染成藍(lán)色。鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是細(xì)胞骨架的染色神器，羅丹明標(biāo)記的Phalloidin（TRITC- Phalloidin）可將細(xì)胞染成橙紅色，DAPI與Phalloidin染色液是研究細(xì)胞形態(tài)變化時經(jīng)常用到的兩種共染的試劑，染色效果可見圖1[1]：A1-E1用TRITC-鬼筆環(huán)肽（橙紅）染色的細(xì)胞骨架免疫熒光圖；A2-E2用DAPI（藍(lán)色）染色的細(xì)胞核免疫熒光圖；A3-E3合并的L929細(xì)胞免疫熒光染色圖。圖2[2]是S100A16過表達(dá)或下調(diào)前后PDAC細(xì)胞形態(tài)的變化。
圖1 P34HB纖維支架敷料培養(yǎng)的L929的細(xì)胞毒性評估[1]。
圖2 試劑處理后PDAC細(xì)胞形態(tài)變化[2]。
注意事項(xiàng)：
1.熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。2、避免反復(fù)凍融，否則容易失效。3、DAPI對人體有刺激性，注意適當(dāng)防護(hù)。4、鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量 LD50 約 2mg/kg）。
細(xì)胞染色專題---熒光染料選擇指南
參考文獻(xiàn)：
[1] Li J, Chen JN, Peng ZX, et al. Multifunctional Electrospinning Polyhydroxyalkanoate Fibrous Scaffolds with Antibacterial and Angiogenesis Effects for Accelerating Wound Healing[J]. Applied Materials & Interfaces. 2022.
[2] Li T, Ren TY, Huang CM, et al. YS100A16 induces epithelial-mesenchymal transition in human PDAC cells and is a new therapeutic target for pancreatic cancer treatment that synergizes with gemcitabine[J]. Biochemical Pharmacology 189 (2021) 114396.
常見問題解答（FAQ）
| Question | Answer |
| Q1：用DAPI和鬼筆環(huán)肽染細(xì)胞的先后順序是什么？ | 一般情況下先用鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞骨架進(jìn)行染色20~40分鐘，PBS清洗細(xì)胞2次，再用DAPI復(fù)染10~20分鐘?？筛鶕?jù)實(shí)際染色情況縮短或延長時間。 |
| Q2：用DAPI染細(xì)胞核時，整張圖片顯示藍(lán)色是什么原因？ | 染色時應(yīng)注意滴加量不要太多，否則會造成整張圖像呈現(xiàn)藍(lán)色背景，只需覆蓋上薄薄的一層即可。此外，熒光染料存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。 |
| Q3：DAPI染色中避光的操作到底要多嚴(yán)格才不至于影響結(jié)果？ | DAPI相對很容易染上色，避光處理時加樣等操作短時見光沒有關(guān)系，但是不操作的時候需要暗盒或錫紙包裹，染色后應(yīng)盡快檢測。 |
| Q4：我的細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)染了帶有GFP的質(zhì)粒，應(yīng)該選擇哪種鬼筆環(huán)肽？ | 可以選擇TRITC（橙紅）或是Fluor 700（遠(yuǎn)紅）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽。 |
| Q5：鬼筆環(huán)肽有好多種，它們的區(qū)別是什么？我應(yīng)該如何選擇？ | 主要是熒光基團(tuán)的差異，激發(fā)不同的熒光顏色，用來區(qū)分共染時其他熒光染料的顏色，選擇時應(yīng)滿足機(jī)器激發(fā)和發(fā)射波長。 |
| Q6：鬼筆環(huán)肽可以染活細(xì)胞嗎？什么染色劑可以染活細(xì)胞？ | 鬼筆環(huán)肽不能直接應(yīng)用于活細(xì)胞的染色，因?yàn)樗鼰o法穿越細(xì)胞膜。DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。 |
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