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線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-10)
產(chǎn)品貨號(hào)：M8650
產(chǎn)品規(guī)格：100T
產(chǎn)品內(nèi)容：
保存條件：
-20 ℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融，有效期一年。  超純水和 JC-1  染色緩沖液（5 ×）也可 4 ℃保存。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-10)是一種以 JC-1  為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
JC-1  是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位 Ψm  △ 的理想熒光探針?？梢詸z測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1  聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1  不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí) JC-1  為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。
線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò) JC-1  從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用 JC-1  從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。
JC-1  單體的大激發(fā)波長(zhǎng)為 515nm  ，大發(fā)射波長(zhǎng)為 529nm  ；JC-1  聚合物的大激發(fā)波長(zhǎng)為
585nm  ，大發(fā)射波長(zhǎng)為 590nm  。實(shí)際觀察時(shí)，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。
本試劑盒提供了 CCCP  作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于六孔板中的樣品，本試劑盒共可
以檢測(cè) 100  個(gè)樣品；對(duì)于 12  孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè) 200  個(gè)樣品。
操作步驟： 
1、JC-1 染色工作液的配制：
六孔板每孔所需 JC-1  染色工作液的量為 1mL  ，其他培養(yǎng)器皿的 JC-1  染色工作液的用量以此類(lèi)推；
對(duì)于細(xì)胞懸液每 50～100 萬(wàn)細(xì)胞需 0.5mL JC-1  染色工作液。取適量 JC-1  （200×）， 按照每 50µL JC-1 （200
×）加入 8mL  超純水的比例稀釋 JC-1  。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-1  。然后再加入 2mL JC-1  染色緩沖
液（5 ×），混勻后即為 JC-1  染色工作液。
2、 、、 、陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置 陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置： ：： ：
把試劑盒中提供的 CCCP（10mM  ）推薦按照 1  1000  ∶ 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋 10µM  ，處理
細(xì)胞 20  分鐘。隨后按照下述方法裝載 JC-1  ，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè)。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，通常 10µM CCCP
處理 20 分鐘后線粒體的膜電位會(huì)*喪失， JC-1  染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng) JC-1  染色后
應(yīng)顯示紅色熒光。對(duì)于特定的細(xì)胞，CCCP  的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資
料決定。
3、 、、 、對(duì)于懸浮細(xì)胞 對(duì)于懸浮細(xì)胞： ：： ：
（1）取 10～60  萬(wàn)細(xì)胞，重懸于 0.5mL  細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
（2）加入 0.5mL JC-1  染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育 20  分鐘。
（3）在孵育期間，按照每 1mL  JC-1  染色緩沖液（5×）加入 4mL  蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1  染色
緩沖液（1×），并放置于冰浴。
（4）37℃孵育結(jié)束后，600g 4 ℃離心 3  ～4  分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。
（5）用 JC-1  染色緩沖液 （1×）洗滌 2  次：加入 1mL JC-1 染色緩沖液 （1×）重懸細(xì)胞， 600g 4 ℃離心 3～
4  分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入 1mL JC-1  染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4  ℃離心 3～4  分鐘，
沉淀細(xì)胞，棄上清。
（6）再用適量 JC-1  染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分
光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析。
4、 、、 、對(duì)于貼壁細(xì)胞 對(duì)于貼壁細(xì)胞： ：： ：
注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以先收集細(xì)胞，重懸后參
考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。
（1）對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用 PBS  或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一
次，加入 1mL  細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
（2）加入 1mL JC-1  染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20  分鐘。
（3）在孵育期間，按照每 1mL  JC-1  染色緩沖液（5×）加入 4mL  蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1  染色
緩沖液（1×），并放置于冰浴。
（4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-1  染色緩沖液（1×）洗滌 2  次。
（5）加入 2mL  細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
（6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5、 、、 、對(duì)于純化的線粒體 對(duì)于純化的線粒體： ：： ：
（1）把配制好的 JC-1  染色工作液再用 JC-1  染色緩沖液（1×）稀釋 5  倍。
（2）0.9mL 5  倍稀釋的 JC-1  染色工作液中加入 0.1mL  總蛋白量為 10  ～100 µg  純化的線粒體。
（3）用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描（time scan  ），激
發(fā)波長(zhǎng)為 485nm  ，發(fā)射波長(zhǎng)為 590nm  。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為 485nm  時(shí)，可以在
475～520nm  范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)。另外，也可以參考下面步驟 6  中的波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行熒光檢測(cè)。
（4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6  。
6、 、、 、熒光觀測(cè)和結(jié)果分析 熒光觀測(cè)和結(jié)果分析： ：： ：
檢測(cè) JC-1  單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm  ，發(fā)射光設(shè)置為 530nm  ；檢測(cè) JC-1  聚合物時(shí)，可以
把激發(fā)光設(shè)置為 525nm  ，發(fā)射光設(shè)置為 590nm  。
注意：此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在大激發(fā)波長(zhǎng)和大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微
鏡觀察，檢測(cè) JC-1  單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如觀察 GFP  或 FITC 時(shí)的設(shè)置；檢測(cè) JC-1
聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3  時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降，
并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。
注意事項(xiàng)： ：： ：
1.   JC-1 （200×）在 4 ℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以 20～25℃
水浴溫育片刻全部融解后使用。
2.   必須先把 JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入 JC-1  染色緩沖液（5×）。
不可先配制 JC-1  染色緩沖液（1×）再加入 JC-1（200×），這樣 JC-1  會(huì)很難充分溶解，會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的
檢測(cè)。
3.   裝載完 JC-1  后用 JC-1  染色緩沖液（1×）洗滌時(shí)，使 JC-1  染色緩沖液（1×）保持 4 ℃左右，此時(shí)的洗
滌效果較好。
4.   JC-1  探針裝載完并洗滌后盡量在 30 分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)前需冰浴保存。
5.   請(qǐng)勿把 JC-1  染色緩沖液（5×）全部配制成 JC-1  染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過(guò)程中需直接使用
JC-1  染色緩沖液（5×）。
6.   如果發(fā)現(xiàn) JC-1  染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在 37℃加熱。
7.   CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請(qǐng)注意小心防護(hù)。

相關(guān)文獻(xiàn)：

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