單分子成像定位超分辨顯微鏡
當(dāng)前通過光活化或光開關(guān)及位置測定的超高分辨熒光成像使我們可以理解細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼。在近些年所有超分辨的成像技術(shù)中，定位顯微鏡獨樹一幟，因為它傳達(dá)著單分子的分布、距離等信息。在分子水平直接產(chǎn)生實驗反饋觀察復(fù)雜的生理反應(yīng)，另外有效的染料標(biāo)識的出現(xiàn)可獲得真實的分子水平的分辨率，這使得定位顯微鏡更加強(qiáng)大。
定義超分辨技術(shù)
傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡在xy方向的分辨極限是250nm，z軸方向是>450－700nm。這個極限也被叫做點擴(kuò)散函數(shù)PSF，是一個點的光通過顯微鏡被衍射后形成的固定尺寸，它也可以是量度的zui小尺寸的點光源或被顯微鏡可分辨的zui小物體。小于PSF的點被顯微鏡認(rèn)為是與PSF相同的點。物體之間越接近于PSF寬度越不能被單獨識別。通常PSF寬度是采用Rayleigh標(biāo)準(zhǔn)：R=0.61λ/NA，NA指數(shù)值孔徑。任何克服了傳統(tǒng)顯微鏡極限至少二者其一的技術(shù)都可被稱作超分辨技術(shù)。需要指出的是，當(dāng)顯微鏡需要分辨兩個或者更多點光源的時候，很難突破光學(xué)分辨率的極限來進(jìn)行定位．而當(dāng)顯微鏡的物鏡視野下僅有單個熒光分子的時候，通過特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度可以很容易超過光學(xué)分辨率的極限，達(dá)到納米級。
設(shè)備要求
定位顯微鏡搭載起來很容易，它需要一套寬場顯微鏡，同時搭載激光光源和激光耦合器，一套靈敏的CCD系統(tǒng)，還有有效的開源的軟件算法，像奧林巴斯Olympus可以提供界面友好的集成的這樣一套系統(tǒng)cell^TIRF，可作為多通道的多維的超高分辨單分子定位的檢測平臺，它擁有其*的技術(shù)優(yōu)勢和相關(guān)的配套系統(tǒng)以保證商業(yè)市場上可獲得的zui高單分子檢測級別的同步多色TIRF光學(xué)質(zhì)量。其TIRF物鏡是相關(guān)領(lǐng)域研究大牛的，實驗條件通過實驗管理界面很容易的控制?？偟膩碚f奧林巴斯的TIRF主打市場。
算法
定位顯微鏡確實需要圖像處理的技術(shù)，基于高分辨重建圖像，我們可以用下面開源的軟件算法來進(jìn)行模擬定位的計算：
- Samuel Hess
- Xiaowei Zhuang
- Ricardo Henriques (QuickPALM plug in Image J)
標(biāo)本準(zhǔn)備
為了得到更好的分辨率的應(yīng)用zui主要依賴于標(biāo)本的制備，而zui小程度的是依賴于顯微鏡和算法，每個用戶的應(yīng)用需要找到適合自己標(biāo)本的條件，比如：激光強(qiáng)度、照射時間、區(qū)域和重復(fù)次數(shù)、背景抑制、染料標(biāo)注表達(dá)水平等因素。同時載物臺的穩(wěn)定性及Z軸的穩(wěn)定性也是為了獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)而必須考慮的因素。
顯微鏡技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展經(jīng)常給我們帶來戲劇性的跳躍，生物學(xué)家不再受限于僅僅從總體運動的可視的分子相互作用上進(jìn)行推理，而是當(dāng)他們劇烈作用時，可能看到單個的分子。超高分辨率顯微鏡可以給生物學(xué)家在一個全新的水平上研究細(xì)胞內(nèi)部的工作狀態(tài)。
