椎間盤（IVD）退變（IDD）和相關(guān)疾病是導(dǎo)致腰痛的重要原因，研究表明，IDD 的病因是多因素的。椎間盤是人體最大的無血管組織，由內(nèi)髓核（NP）、周圍的纖維環(huán)（AF）和相鄰的軟骨終板組成。健康椎間盤的特點是 AF 外表面的血管有限。然而，健康椎間盤如何抑制血管形成的機制仍不清楚。

在胚胎發(fā)生期間，桿狀脊索從椎體中被截留，并在胎兒早期很快發(fā)育成 NP 組織，而血管則從內(nèi)部區(qū)域退去。因此，大的、空泡化的脊索細(xì)胞（NCs）保留在 NP 組織中。越來越多的證據(jù)表明，NCs 在椎間盤發(fā)育和功能中發(fā)揮著重要作用。特別是，NCs 不僅可以激活 NP 細(xì)胞（NPs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），而且還可以抑制血管向內(nèi)生長。因此，NCs 由于其治療潛力而受到了相當(dāng)大的關(guān)注。然而，椎間盤中 NCs 的抗血管生成作用仍不清楚。

外泌體（Exosomes）是直徑范圍為 30-150 nm 的細(xì)胞外囊泡，由多種細(xì)胞類型分泌，包括干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。已經(jīng)表明，外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、骨關(guān)節(jié)炎和血管生成中發(fā)揮重要作用。然而，沒有研究表明 NCs 是否產(chǎn)生外泌體及其對椎間盤穩(wěn)態(tài)的影響。

在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科及放射科、空軍第986醫(yī)院骨外科、**口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室的一項聯(lián)合研究中，假設(shè) NCs 可以分泌 NC 衍生的外泌體（NC-exos），考慮到 NCs 和生物力學(xué)的密切關(guān)系，NC-exos 可能會受到壓縮載荷的影響。此外，NC-exos 可能通過向血管內(nèi)皮細(xì)胞遞送生物活性物質(zhì)，在抑制椎間盤血管生成中發(fā)揮重要作用。對這些影響的分析可能有助于闡明 NCs 在 IDD 治療中的應(yīng)用機制。

已經(jīng)表明，NCs 對具有各種影響的機械應(yīng)力作出反應(yīng)。因此，實驗首先檢測了壓縮負(fù)荷對 NC-exos 的影響。在不同的壓縮負(fù)荷（0 MPa、0.5 MPa、1.0 MPa）下培養(yǎng) NCs，提取和分析 NC-exos。NCs 在壓縮負(fù)荷培養(yǎng)后表現(xiàn)出更高的 NC-exos 濃度（圖1 J）。然而，在壓縮負(fù)荷培養(yǎng)后，細(xì)胞活力沒有觀察到顯著差異（圖1 k）。

圖1 NC 衍生的外泌體（NC-Exos）對壓縮載荷的響應(yīng)。

為了評估 NC-exos 對血管生成的影響，來自不同壓縮負(fù)荷培養(yǎng)物的 NC-exos 用于內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成檢測。與其他組相比，用 0.5 MPa/NC-exos 處理顯著抑制了 HUVECs 的遷移（圖2 A、C）。此外，0.5 MPa/NC-exos 對 HUVECs 遷移表現(xiàn)出劑量依賴性抑制作用（圖2 B、D）。而且，0.5 MPa/NC-exos 在管形成試驗中顯示出抑制血管生成作用（圖2 E-H)。此外，細(xì)胞增殖被 0.5 MPa/NC-exos 抑制（圖2 I-L）。這些數(shù)據(jù)表明，由 0.5-MPa 壓縮負(fù)荷誘導(dǎo)的 NC-exos 抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。

圖2 0.5 MPa/NC-Exos 抑制血管生成。

為了探索 0.5-MPa/NC-exos 在抗血管生成作用中的有效成分，采用 PROse K（蛋白酶 K）或 RNase A 的預(yù)處理來排除蛋白質(zhì)或 RNAs 的影響。結(jié)果表明，RNase A 預(yù)處理的 0.5 MPa/NC-exos 對內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管生成和增殖表現(xiàn)出減弱的抑制作用，而 PROse K 預(yù)處理與未處理組相比沒有顯著影響（圖3 A-C），表明 RNAs 在 0.5 MPa/NC-exos 的抗血管生成作用中起重要作用。

研究表明，外泌體是有效的載體，可將 microRNAs（miRNAs）從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞。因此，假設(shè) miRNAs 通過 NC-exos 從 NCs 轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞。為了在 0.5 MPa/NC-exos 中識別潛在的抗血管生成相關(guān) miRNAs，在有或沒有 0.5 MPa 培養(yǎng)的情況下使用 NC-exos 進(jìn)行 miRNA 陣列。在不同表達(dá)的 miRNAs 中，有 10 個 miRNAs（miR-140-5p、miR-182、miR-183-5p、miR-205、miR-211-3p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-361-5p、miR-434-3p、miR-541-5p）顯著上調(diào)。熱圖表示 miRNAs 的雙向?qū)哟尉垲惖慕Y(jié)果（圖3 D）。火山圖顯示 10 個上調(diào)和 5 個下調(diào)的 miRNAs（圖3 E）。

為了評估上調(diào)的 miRNAs 對血管生成的影響，miRNAs 分別在 HUVECs 中過表達(dá)。在這些 miRNAs 中，miR-140-5p的上調(diào)對內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成有顯著的抑制作用。證實了 miR-140-5p 在 0.5 MPa/NC-exos 中的表達(dá)（圖3 F）。

然后，用 Cy3 標(biāo)記的 miR-140-5p 模擬物轉(zhuǎn)染 NCs 并在壓縮負(fù)荷下培養(yǎng)，用 PKH67 標(biāo)記 NC-exos 并與 HUVECs 一起孵育。HUVECs 在 0.5-MPa/NC-exos 組中顯示 Cy3 和 PKH67 熒光陽性，而 HUVECs 在 0 MPa 和 1.0 MPa 組中僅顯示 PKH67 熒光（圖3 G）。

然后，檢測 HUVECs 中 miR-140-5p 的表達(dá)，RT-PCR 結(jié)果顯示，HUVECs 與 0.5 MPa/NC-exos 孵育后 miR-140-5p 水平升高，而其他組中未檢測到上調(diào)（圖3 H）。隨著外泌體內(nèi)化抑制劑 Annexin V 的應(yīng)用，0.5 MPa/NC-exos 失去了上調(diào) HUVECs 中 miR-140-5p 表達(dá)的能力（圖3 I）。

這些結(jié)果表明，miR-140-5p 是 0.5 MPa/NC-exos 中抗血管生成作用的主要貢獻(xiàn)者。

圖3 miR-140-5p 通過 0.5 MPa/NC-Exos 轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細(xì)胞并抑制血管生成

為了評估 miR-140-5p 如何調(diào)節(jié)抗血管生成機制，使用了三種 mRNA 靶標(biāo)預(yù)測算法（miRDB、miRWalk 和 TargetScan）來識別 miR-140-5p 的潛在下游靶標(biāo)。在潛在目標(biāo)中，Wnt11 在所有數(shù)據(jù)庫中都有重疊（圖4 A）。為了檢測 Wnt11 是否是 miR-140-5p 的靶點，將 Wnt11 的 3' UTR 克隆到 HEK293A 和 HUVECs 中的熒光素酶質(zhì)粒 psiCHEK-2 中。值得注意的是，Wnt11 的 3' UTR 的熒光素酶活性被 miR-140-5p 抑制（圖4 B）。

然后檢測了 Wnt/β-catenin 在 HUVECs 核和質(zhì)中的表達(dá)。結(jié)果表明，HUVECs 中 miR-140-5p 的過表達(dá)下調(diào) Wnt11 表達(dá)并抑制 β-catenin 核積累，而 Wnt11 表達(dá)的恢復(fù)消除了這些影響（圖4 C）。

此外還檢查了 HUVEC 培養(yǎng)物中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的水平，因為它們與 Wnt/β-catenin 調(diào)控密切相關(guān)。在 miR-140-5p 過表達(dá)的 HUVEC 培養(yǎng)物中，MMP-2 和 MMP-7 的水平下調(diào)，而恢復(fù) Wnt11 恢復(fù)了它們的表達(dá)（圖4 D）。此外，miR-140-5p 的過表達(dá)抑制 HUVEC 遷移、塊莖形成和增殖，而 Wnt11 的恢復(fù)消除了 miR-140-5p 誘導(dǎo)的血管生成抑制（圖4 E-J）。

圖4 miR-140-5p 通過其功能靶標(biāo) Wnt11 調(diào)控抗血管生成。

為了探索 0.5 MPa/NC-exos 對內(nèi)皮細(xì)胞的影響，檢測了 0.5 MPa/NC-exos 是否會沉默 Wnt11，從而抑制 HUVECs 的血管生成。0.5 MPa/NC-exos降低了 Wnt11 3' UTR 的熒光素酶活性，而 0 MPa/NC-exos 或 1.0 MPa/NC-exos則不能。此外，添加 miR-140-5p 抑制劑或外泌體內(nèi)化抑制劑 Annexin V 顯示，Wnt11 3' UTR 的熒光素酶活性恢復(fù)，表明 HUVECs 中的 Wnt11 可以被源自 0.5 MPa/NC-exos 的 miR-140-5p 沉默（圖5 A）。

然后，在 0.5 Mpa/NC-exos 培養(yǎng)的 HUVECs 中檢測 Wnt/β-catenin 的表達(dá)。0.5 MPa/NC-exos 顯著降低 Wnt11 的表達(dá)并抑制 β-catenin 核積累（圖6 B）。Annexin V 或 miR-140-5p 抑制劑的應(yīng)用消除了這些影響。同樣，恢復(fù)的 Wnt11 表達(dá)挽救了 β-catenin 核積累（圖5 B、C）。此外，MMP-2 和 MMP-7 的水平在 0.5 MPa/NC-exo 處理的 HUVEC 培養(yǎng)物中下調(diào)，而添加 Annexin V、miR-140-5p 抑制劑或恢復(fù)的 Wnt11 增加了它們的水平（圖5 D）。體外遷移試驗、管形成試驗和增殖試驗表明，0.5 MPa/NC-exos 的處理抑制了血管生成，而 miR-25-3p 抑制劑或Annexin V 緩解其促進(jìn)血管生成的功能。此外，受體細(xì)胞中 Wnt11 的恢復(fù)抑制了這些影響（圖5 E-H）。這些結(jié)果表明，0.5 MPa/NC-exos 足以通過轉(zhuǎn)移 miR-140-5p 并靶向 Wnt/β-catenin 通路來抑制血管生成。

圖5 0.5 MPa/NC-Exos 沉默 Wnt11 并抑制 HUVECs 中的血管生成。

圖6 NP的外泌體miR-140-5p表達(dá)與椎間盤血管生成呈負(fù)相關(guān)。

為了確定 NP 組織中外泌體 miR-140-5p 的水平是否與椎間盤血管生成相關(guān)，檢查了來自 IDD 患者或特發(fā)性脊柱側(cè)凸的 NP 組織。免疫熒光染色顯示，IDD 的血管生成表達(dá)高于特發(fā)性脊柱側(cè)凸（圖6 A），而在特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者的 H&E 染色的 NP 組織中觀察到更多的 NC 樣細(xì)胞（圖6 B）。然后，從 NP 組織培養(yǎng)基中分離出外泌體，并檢測外泌體 miR-140-5p 的表達(dá)（圖6 C）。RT-PCR 分析顯示，來自 NP 組織來源的外泌體的 miR-140-3p 在 IDD 患者中下調(diào)（圖6 D）。統(tǒng)計分析顯示，miR-140-5p 水平與血管生成水平呈負(fù)相關(guān)（圖6 E），表明 NP 組織中 miR-25-3p 的下調(diào)可能導(dǎo)致血管生成升高。這些數(shù)據(jù)表明，來自 NP 外泌體的 miR-140-5p 表達(dá)降低與椎間盤血管生成有關(guān)。

最終在 IDD 動物模型中確定了 0.5 MPa/NC-exos 對椎間盤血管形成的影響。0.5 MPa/NC-exos 在椎間盤 NP 組織中的應(yīng)用顯示 CD34 表達(dá)降低，表明其在體內(nèi)具有抗血管生成作用（圖7 A、B）。此外，通過微型計算機斷層掃描評估獲得的椎間盤高度指數(shù)（DHI）評估椎間盤退變程度。對照組DHI保持不變，而IDD組術(shù)后DHI持續(xù)下降（圖7 C、D）。在第 6 周，與 IDD 組相比，0.5 MPa/NC-exos 的治療顯著增加了 DHI。這些結(jié)果表明，0.5 MPa/NC-exos 對退變椎間盤具有治療作用，具有體內(nèi)抗血管生成作用。

圖7 0.5 MPa/NC-Exos 減少退變椎間盤組織的血管化。

圖8 0.5 MPa / NC-exos通過miR-140-5p / Wnt/β-catenin軸抑制血管生成的示意圖

總之，該研究結(jié)果表明，0.5 MPa/NC-exos 通過調(diào)控血管上皮細(xì)胞中的 miR-140-5p/Wnt/β-catenin 軸來抑制血管生成，為了解 NCs 的抗血管生成機制提供了見解。因此，目前的研究增加了我們對 NCs 治療 IDD 的潛力的理解。

參考文獻(xiàn)：Sun Z, Liu B, Liu ZH, Song W, Wang D, Chen BY, Fan J, Xu Z, Geng D, Luo ZJ. Notochordal-Cell-Derived Exosomes Induced by Compressive Load Inhibit Angiogenesis via the miR-140-5p/Wnt/β-Catenin Axis. Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Oct 22;22:1092-1106. doi: 10.1016/j.omtn.2020.10.021. PMID: 33294295; PMCID: PMC7691158.

圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻(xiàn)

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