導(dǎo)讀

生物藥發(fā)生聚集后藥效會(huì)明顯減弱，還可能導(dǎo)致人體出現(xiàn)休克，島津基于流動(dòng)成像技術(shù)開發(fā)的粒子分析系統(tǒng)，對生物藥中亞可見類聚集體以及不溶性微粒物或外源性組分檢測提供了全新分析手段。

受疫情影響，世界各國經(jīng)濟(jì)遭受重創(chuàng)，在面臨資本寒冬的大環(huán)境中生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)*，逆勢增長，儼然成為世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及健康保障的指明燈。生物藥可對病原體進(jìn)行特異性攻擊，副作用小，藥效顯著，但易受到環(huán)境溫度、壓力、存儲(chǔ)條件、外界異物引入等因素影響而發(fā)生聚集。研究表明，生物藥發(fā)生聚集后藥效會(huì)明顯減弱或消失，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)因免疫反應(yīng)而導(dǎo)致人體出現(xiàn)休克癥狀。

對于生物聚集體的分析，小于100nm的不可見聚集體通常使用空間排阻色譜法（SEC）檢測，對于10um以上可見區(qū)聚集體美國藥典和日本藥典規(guī)定使用光阻法進(jìn)行檢定，但在100nm至10um之間并無合適的定量評價(jià)方法。2020版中國藥典第四部關(guān)于不溶性微粒物檢查，第一法光阻法，第二法顯微計(jì)數(shù)法。光阻法只能給出計(jì)數(shù)濃度，不能查看粒子形貌及聚集狀態(tài)，顯微計(jì)數(shù)法雖然能查看粒子形貌及個(gè)數(shù)，但檢定效率低且代表性差。

圖1 生物聚集體大小及粒徑范圍分布

島津iSpect DIA-10基于流動(dòng)成像技術(shù)開發(fā)的粒子分析系統(tǒng)綜合了粒度、顯微觀察、粒子計(jì)數(shù)三類儀器的特點(diǎn)，可以精確捕捉粒子形貌、粒徑大小分布、能對不同大小粒子進(jìn)行有效區(qū)分并給出對應(yīng)粒徑范圍粒子的計(jì)數(shù)濃度結(jié)果，低僅需50uL樣品消耗且有非常高的靈敏度。對于生物藥中亞可見類聚集體的檢定以及相關(guān)的不溶性微粒物或外源性組分檢查可提供一個(gè)全新分析手段。

圖2 島津iSpect DIA-10動(dòng)態(tài)顆粒圖像分析系統(tǒng)

應(yīng)用實(shí)例  生物藥中不溶性亞可見微粒物的檢查

樣品處理：人體免疫球蛋白（1mg/mL）兩份，一份80℃加熱3min，一份機(jī)械攪拌10min

樣品分析：使用iSpect DIA-10分別觀察其蛋白聚集形成狀態(tài)

圖3 80℃加熱3min后粒子狀態(tài)               圖4 機(jī)械攪拌10min后粒子狀態(tài)

圖5 粒子檢定結(jié)果

生物蛋白聚集體的粒徑范圍一般在0.2～10um之間，傳統(tǒng)的蛋白聚集體評價(jià)方法中存在“無法一次性完成亞可見區(qū)的測定、”無法邊施壓（加熱或機(jī)械刺激）邊測定“、”無法回收已測樣品“和“無法進(jìn)行定量”等問題。島津開發(fā)的生物醫(yī)藥聚集體評價(jià)系統(tǒng)Aggregates Sizer可以完美解決上述問題。

圖6 生物聚集體評價(jià)系統(tǒng)Aggregates Sizer

? 定量評價(jià)生物聚合體濃度（ug/mL）

? 高靈敏度生物聚合體分析，一次僅需0.4mL

? 具有溫度控制及機(jī)械攪拌功能

? 間隔1秒的超快速聚集過程監(jiān)控

? 可進(jìn)行超過15小時(shí)的連續(xù)不間斷測定

應(yīng)用實(shí)例  不同溫度及機(jī)械壓力刺激下，生物蛋白聚集情況分析

樣品：靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）

熱壓力處理：在70℃下對1mL IVIC溶液進(jìn)行5、7、9分鐘培養(yǎng)后，取0.4ml進(jìn)行測定

機(jī)械刺激處理：5mL IVIC溶液室溫中按190次/分鐘速度攪拌，進(jìn)行8個(gè)小時(shí)的連續(xù)測定

通過Aggregates Sizer生物醫(yī)藥聚集體評價(jià)系統(tǒng)對聚集體粒徑、生成的聚集體濃度隨時(shí)間的變化進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果如圖7、圖8所示。由圖可知，施加熱壓力時(shí)，只在0.2um附近增加聚合體，而1um以上的粒徑處并未生成聚集體。施加機(jī)械刺激時(shí)，隨著時(shí)間的增加，可以發(fā)現(xiàn)在0.2～10um區(qū)域聚集體增加。FDA認(rèn)證中將亞可見區(qū)分為0.2～2um和2～10um兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行分別評價(jià)，而使用Aggregates Sizer只需一次測定即可得到整個(gè)區(qū)域的聚合體生成量信息。Aggregates Sizer采用的qLD法可以有效評價(jià)蛋白質(zhì)在研發(fā)制造過程中受熱壓或機(jī)械刺激對生物藥品的影響評價(jià)。

圖7  70℃加熱                          圖8  190次/分鐘速度攪拌

總結(jié)

生物藥具有副作用小藥效顯著的特點(diǎn)，但在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用過程中容易產(chǎn)生聚集而影響藥效，在生物聚集體大量存在的100nm～10um粒徑范圍內(nèi)并無有效的評價(jià)方法，無相關(guān)的在線模擬實(shí)驗(yàn)（溫度、機(jī)械壓力影響）手段、無法進(jìn)行定量分析、無法回收已測樣品等，針對這一系列問題，島津開發(fā)的Aggregates Sizer生物醫(yī)藥聚集體評價(jià)系統(tǒng)以及基于流動(dòng)成像技術(shù)開發(fā)的iSpect DIA-10粒子分析系統(tǒng)可以很好的解決上述問題，可為生物藥開發(fā)及品質(zhì)監(jiān)控提供全新的解決方案。