高分辨率成像質(zhì)譜應(yīng)用于大鼠視網(wǎng)膜中氯喹的分布分析

在藥物研發(fā)過程中，候選化合物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)分析是非常關(guān)鍵的步驟。該分析不僅可以掌握其藥效藥理，還可以得到和毒性評(píng)價(jià)有關(guān)的信息。通常，使用放射性自顯影技術(shù)(Autoradiography: ARG)和熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法進(jìn)行分析。但是，使用ARG的方法成本高，而且一方面這些方法無法區(qū)別原藥和代謝物，另一方面標(biāo)記物質(zhì)的行為可能與未標(biāo)記物存在差異。

因此，最近成像質(zhì)譜分析法，即不進(jìn)行標(biāo)記即可對(duì)候選化合物進(jìn)行檢測(cè)的方法備受矚目。質(zhì)譜成像法除了能夠在無標(biāo)記的情況下對(duì)各種物質(zhì)的分布進(jìn)行分析，還能夠使用同一切片同時(shí)分析原藥及其代謝物，有望在今后的藥物研發(fā)領(lǐng)域得到應(yīng)用，取得新的突破。本文為您介紹使用成像質(zhì)譜顯微鏡iMScope TRIO對(duì)氯喹給藥后大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行檢測(cè)的示例。

1.大鼠視網(wǎng)膜中氯喹的高空間分辨率成像

在本次分析中，對(duì)給予抗瘧劑藥物氯喹的大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行分析。圖1為氯喹的結(jié)構(gòu)式。使用氯喹標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，對(duì)基質(zhì)及測(cè)定模式進(jìn)行優(yōu)化，表1為組織切片的分析條件。

圖1 氯喹的結(jié)構(gòu)式

表1 分析條件

使用成像質(zhì)譜顯微鏡iMScope TRIO進(jìn)行高空間分辨率成像，發(fā)現(xiàn)在約10μm厚的視網(wǎng)膜色素上皮周圍有氯喹的分布(圖2和圖3)。

圖2 組織切片上的MS/MS質(zhì)譜圖

圖3 光學(xué)圖像和MS/MS質(zhì)譜圖像

在測(cè)定氯喹時(shí)，如果使用成像質(zhì)譜分析法常用的MS模式，因受到生物體衍生雜質(zhì)帶來的離子抑制、干擾的影響，無法得到清晰的MS圖像(此處數(shù)據(jù)省略)。在本次分析中，通過iMScope TRIO的MS/MS模式進(jìn)行測(cè)定，提高靈敏度，能夠獲得10μm的高空間分辨率下的MS/MS圖像。

2.大鼠眼球中氯喹的高速成像

在藥代動(dòng)力學(xué)研究過程中，為了闡明藥物分子在細(xì)胞及器官水平的特征分布區(qū)域，分別需要在高空間分辨率及中等空間分辨率獲得藥物分子的分布信息。本實(shí)驗(yàn)使用MS/MS模式測(cè)定在中等分辨率(50μm)下測(cè)定大鼠眼球整體的氯喹分布情況，分析條件如表2所示。

表2 分析條件

圖4 組織切片上氯喹的MS/MS產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖，激光直徑50μm

雖然使用了更大的激光直徑，有可能帶來存在噪音高、離子抑制等問題，iMScope TRIO依然能夠檢測(cè)得到具有較高信噪比的氯喹特征碎片，并獲得清晰的質(zhì)譜圖像。成像質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的采集速度取決于目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域中所包含的點(diǎn)數(shù)。iMScope TRIO能夠獨(dú)立更改激光直徑及采集間隔等參數(shù)，從而能夠輕松控制采集速度及圖像尺寸，并且不會(huì)影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。

3.基質(zhì)涂敷方式的比較

在氯喹成像質(zhì)譜分析中，比較了2種不同的MALDI基質(zhì)涂敷方式。圖5顯示了有升華法獲得的成像結(jié)果(基質(zhì)升華方式的示意圖如圖6所示)?；|(zhì)升華有iMLayer升華儀自動(dòng)完成，而噴霧方式由手動(dòng)完成。噴霧方式獲得成像結(jié)果如圖7所示。對(duì)比兩種方式的檢測(cè)結(jié)果，升華法獲得了更加清晰尖銳的氯喹分布圖像，而噴霧的結(jié)果則看起來會(huì)有一些擴(kuò)散，如圖7所示。前處理方式的優(yōu)化依然取決于組織切片的特性以及所使用的基質(zhì)類型。如示例中的結(jié)果，前處理步驟對(duì)最終成像結(jié)果的圖像質(zhì)量有顯著的影響，不僅僅是切片制備的條件同時(shí)基質(zhì)涂敷的過程也很重要。

圖5  升華法獲得的氯喹分布質(zhì)譜圖像

圖7  噴霧法獲得的氯喹分布質(zhì)譜圖像

圖6  基質(zhì)升華方式示意圖

4.在相同切片上進(jìn)行MS和MS/MS成像分析

成像質(zhì)譜分析中，在同樣位置只能采集一次數(shù)據(jù)。但是，使用iMScope TRIO可以調(diào)整激光直徑及采集間隔，因此可以在采集點(diǎn)之間留下未采集區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)更多次的成像分析。圖8顯示了使用激光直徑為5μm，采集間隔為10μm時(shí)，在同一采集區(qū)域內(nèi)進(jìn)行4次成像分析的方式。

圖8  在同一測(cè)定區(qū)域進(jìn)行1次MS分析及3次MS/MS分析的數(shù)據(jù)采集設(shè)置方式示例

文獻(xiàn)題目

《High spatial Resolution Imaging by iMScope TRIO -Imaging of Chloroquine Distribution in Rat Retina-》

使用儀器

島津iMScope TRIO

聲明

1、本文不提供文獻(xiàn)原文。

2、所引用文獻(xiàn)僅供讀者研究和學(xué)習(xí)參考，不得用于其他營(yíng)利性活動(dòng)。