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            島津企業(yè)管理(中國)有限公司

            中藥注射劑評價特色分析方案丨LCMSMS測定注射劑對細胞培養(yǎng)上清液中組胺含量

            時間:2024-11-12 閱讀:195
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            l                      類過敏反應(yīng)

            類過敏反應(yīng)是中藥注射劑臨床應(yīng)用過敏反應(yīng)常見類型,是非經(jīng)典途徑的免疫反應(yīng),其主要機制是細胞受到外界物質(zhì)刺激發(fā)生反應(yīng)后分泌組胺、蛋白酶和花生四烯酸等過敏性介質(zhì)。組胺則是過敏反應(yīng)中最主要的活性過敏介質(zhì)之一,可導(dǎo)致機體產(chǎn)生潮紅、頭痛、水腫、低血壓以及休克等癥狀。通過中藥注射劑對細胞培養(yǎng)液反應(yīng),檢測組胺等過敏介質(zhì)的含量,對判斷中藥注射劑發(fā)生類過敏的風(fēng)險具有一定的應(yīng)用價值。 

             

            l                      組胺檢測方法

            由于生物樣品中組胺的含量低,量化組胺需要高靈敏度的分析方法。目前,組胺的檢測方法主要有 ELISA 檢測法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜和離子色譜法等。

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            l                      分析條件

            液相條件

            HILIC色譜柱(2.1 mm I.D.x150 mm L.3 um)

            流動相:A 相 -20mM 乙酸銨 +0.1% 甲酸水溶液  B相-乙腈

            流速:0.4 mL/min

            柱溫:40℃

            進樣量:5 μL

            洗脫方式:等度洗脫,A:B=10:90(V/V)

            質(zhì)譜條件

            離子化模式:ESI,正離子模式

            離子噴霧電壓:+4.5 kV

            霧化氣流速:氮氣 3.0 L/min

            干燥氣流速:氮氣 15 L/min

            碰撞氣:氬氣

            加熱模塊溫度:400℃

            掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)

            駐留時間:50 ms

            延遲時間:3 ms

            DL管溫度:250℃

             

            MRM優(yōu)化參數(shù)

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            l                      樣品的處理

            取培養(yǎng)一段時間后的細胞培養(yǎng)液,注射入中藥注射試劑刺激細胞后取細胞上清液,并在 0~4℃以3000 r/min 離心10 min,取上清液至進樣小瓶中,從中取 100 μL 至另一離心管中加入 20 μL內(nèi)標溶液,加入200 μL乙腈,充分挑勻室溫 15000 rpm,15 min 再次離心。取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析

             

            l                      析結(jié)果

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            標樣的MRM色譜圖(10ng/mL)

             

            線性關(guān)系

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            組胺校準曲線

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            重復(fù)性實驗

            配制目標物濃度分別為 1、10、100 ng/mL 的混合標樣,平行測定各3次,考察儀器的重復(fù)性,保留時間和峰面積重復(fù)性結(jié)果如下表所示,儀器重復(fù)性良好。

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            回收率及精密度實驗

            稱取組胺標準品,以陰性細胞上清液溶解,使其質(zhì)量濃度為1、10、100 ng/mL,按 前述“0~4℃以3000 r/min 離心10 min……取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析。”處理后,對樣品進行3個加標水平的回收率實驗,每個加標水平平行測定3次, 3 加標水平的平均回收率為 90.4%~93.8%,相對標準偏差為 4.75%~5.78%。結(jié)果表明方法的回收率和精密度均較好。

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            LC-MS/MS測定中藥注射劑對細胞培養(yǎng)上清液組胺含量的分析方法,方法穩(wěn)定、特異性和靈敏度均較高,重復(fù)性好。因此,本方法可用于測定中藥注射劑對細胞培養(yǎng)上清液中組胺含量,對判斷中藥注射劑發(fā)生過敏的風(fēng)險具有一定的應(yīng)用價值。

             

            本文內(nèi)容非商業(yè)廣告,僅供專業(yè)人士參考。

             

             

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