使用熒光底物的直接 ELISA 實(shí)驗(yàn)方案

使用熒光底物的直接 ELISA 實(shí)驗(yàn)方案] 實(shí)驗(yàn)步驟 第 1 天：1.在濾過(guò)的 PBS 中稀釋包被抗體后，在每孔中加入 100 μl 進(jìn)行包被。用封板膜覆蓋酶標(biāo)板，將酶標(biāo)板在 4℃下孵育一夜。  第 2 天：2.將 4 g Block ACE 粉末稀釋于 100 ml 去離子水中，使用其 1:4 稀釋液在每孔中加入 200 μl，在室溫下封閉酶標(biāo)板 3 小時(shí)，封閉期間用封板膜覆蓋酶標(biāo)板。3.洗滌酶標(biāo)板：PBS-T (0.05%  [熒光底物 直接 ELISA 熒光 抗體 包被]

實(shí)驗(yàn)步驟

第 1 天：

1.在濾過(guò)的 PBS 中稀釋包被抗體后，在每孔中加入 100 μl 進(jìn)行包被。用封板膜覆蓋酶標(biāo)板，將酶標(biāo)板在 4℃下孵育一夜。

第 2 天：

2.將 4 g Block ACE 粉末稀釋于 100 ml 去離子水中，使用其 1:4 稀釋液在每孔中加入 200 μl，在室溫下封閉酶標(biāo)板 3 小時(shí)，封閉期間用封板膜覆蓋酶標(biāo)板。

3.洗滌酶標(biāo)板：PBS-T (0.05% Tween20) 250 μl/孔；3x 30 s。

在洗滌或抽吸后，將酶標(biāo)板翻轉(zhuǎn)置于工作臺(tái)的無(wú)塵紙上以除去多余的液體。

4.取 100 μl 剛剛在 10% BlockACE 的 PBS-T 溶液中稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，上樣到酶標(biāo)板，并在 4℃下孵育一夜，孵育期間用封板膜覆蓋酶標(biāo)板。

提前制備標(biāo)準(zhǔn)品。
在將標(biāo)準(zhǔn)品上樣到酶標(biāo)板的當(dāng)天（第二天），現(xiàn)將標(biāo)準(zhǔn)品在例如 10% BSA 的 PBS-T 溶液中稀釋，稀釋至 10 ng/ml 至 500 pg/ml

第 3 天：

5.以 100 μl/孔的量添加稀釋于 PBS 中的生物素化報(bào)告抗體，在室溫下孵育 2 小時(shí)，孵育期間用封板膜覆蓋酶標(biāo)板。

6.以 100 μl/孔的量添加以 1:5000 稀釋于 PBS 中的鏈霉親和素堿性磷酸酶，在室溫下孵育 1 小時(shí)，孵育期間用封板膜覆蓋酶標(biāo)板。

7.洗滌酶標(biāo)板：TBS 250 μl/孔；3x 30 s。

8.以 100 μl/孔的量添加 AttoPhos 熒光底物系統(tǒng)，在室溫下孵育 5-10 分鐘，使信號(hào)放大。使用前應(yīng)將 36 mg AttoPhos 底物與 60 ml AttoPhos 緩沖液混合 24 小時(shí)。確保孔干凈無(wú)污染。

9.在熒光計(jì)（Perkin Elmer 生產(chǎn)的 Victor2）上測(cè)定信號(hào)；激發(fā)波長(zhǎng)：440 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：550 nm。